蜂膠提取物體內(nèi)外抑菌試驗

張相霞 郭振環(huán) 馬 霞* 卞陸杰 劉永錄 王文靜 （山東省平邑縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 273300 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 河南 鄭州）

蜂膠提取物體內(nèi)外抑菌試驗

張相霞①郭振環(huán)②馬 霞②②*卞陸杰②劉永錄②王文靜②（①山東省平邑縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 273300 ②山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 ②河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 河南 鄭州）

為研究蜂膠提取物的體外對大腸桿菌的抑菌作用及體內(nèi)對雞大腸桿菌病的防治效果。采用體外試驗：采用打孔法，測定抑菌圈直徑，采用2倍稀釋法測定最小抑菌濃度；體內(nèi)試驗：本試驗通過人工建立雞大腸桿菌病模型，用蜂膠提取物進行預(yù)防治療，同時設(shè)氟苯尼考西藥對照治療組。觀察臨床癥狀、體重變化等指標。結(jié)果表明，大腸桿菌對蜂膠提取物以及氟苯尼考均高度敏感，蜂膠提取物的MIC為0.013g/m1。蜂膠提取物預(yù)防及治療組和西藥對照組的治愈率和有效率差異不顯著；蜂膠提取物組增加體重作用顯著優(yōu)于西藥對照組。

蜂膠提取物 雞大腸桿菌 體外試驗 體內(nèi)試驗 抑菌

雞大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率很高，不同品種不同日齡的雞均可發(fā)病，給養(yǎng)雞業(yè)造成極大的損失?？咕帉Ρ静‰m有一定的治療和預(yù)防作用，但由于其反復和大量應(yīng)用，極易產(chǎn)生抗藥性，且易造成藥物殘留影響食品安全[1]。中藥具有療效可靠、毒副作用小、不易產(chǎn)生有害殘留等優(yōu)勢[2]，近些年來，中藥天然產(chǎn)物提取物逐漸成為了國內(nèi)外研究的熱點話題，并且在畜禽飼料生產(chǎn)和養(yǎng)殖上受到了廣泛的重視，以其無殘留、無耐藥性、天然抗氧化等特點成為了畜牧行業(yè)的代替抗生素的最佳選擇[3]。

蜂膠是一種天然物質(zhì)，是蜜蜂從植物樹干及花苞上采集的樹膠，混入其上顎腺分泌物和蜂蠟等物質(zhì)而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物質(zhì)，含有多種酮類、酸類、酚類等多種等化合物。研究表明，蜂膠具有抑制抗菌、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用[4]。本試驗體外研究蜂膠提取物對大腸桿菌的抑菌作用及人工誘發(fā)雞大腸桿菌病然后用蜂膠提取物進行預(yù)防治療，旨在確認該藥對雞大腸桿菌病的療效，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

蜂膠提取物(本實驗室制備)、氟苯尼考(河南省康星藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)，規(guī)格500g:10g，批號11110602。

1.2 主要儀器

臺式離心機(型號為TGL-16G)，購自上海安亭科學儀器廠；超凈工作臺(型號為BHC-130011H2)，購自蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司；恒溫振蕩器(型號為HZ-9211K)，購自太倉市科教器材廠。

1.3 體外試驗方法

1.3.1 菌種復活與鑒定 大腸桿菌O78株(C83890)，購自中國獸藥監(jiān)察所。先將菌種接種到GN增菌液中，放置37℃恒溫搖床(180rpm/min)培養(yǎng)8h。然后無菌操作接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16h。細菌呈邊緣整齊、光滑、隆起的紅色菌落。從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑取單個的菌落用革蘭氏染色后，在油鏡下觀察：有許多短桿狀、單個散落的紅色細菌。

1.3.2 對照藥物的選取 用藥敏紙片法[5]測定了臨床常用的10種抗菌藥對菌株的體外抑菌效果。結(jié)果，各抗菌藥的抑菌圈直徑(mm)分別為：丁胺卡那26；卡那霉素25；林可霉素0；強力霉素9；復方新諾明8；氨芐青霉素0；恩諾沙星8；阿莫西林0；氟苯尼考27；新霉素22。以氟苯尼考的抑菌效果最好，因此選擇其作為對照藥物。

1.3.3 抑菌圈直徑測定 先將菌種接種到麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h復壯。選擇呈粉紅色隆起、表面光滑的菌落，接種于新鮮營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h。進行一定比例稀釋后吸取150μl于普通營養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，用“T”形涂布棒涂勻。采用打孔法，用直徑為6mm的打孔器在平板上打孔后，在酒精燈上加熱封底，每板分別加入1種濃度的受試藥品，以剛剛注滿為準。37℃培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑大小。

1.3.4 最小抑菌濃度(MIC)測定 采用2倍稀釋法。將蜂膠提取物在24孔板上作6孔倍比稀釋后，每孔加入培養(yǎng)6~8h的菌液50μl，混勻后37℃培養(yǎng)24h，各孔肉湯轉(zhuǎn)接普通營養(yǎng)瓊脂平板，再培養(yǎng)24h，以無細菌生長孔的藥物最大稀釋度為該藥的MIC。

1.4 體內(nèi)試驗方法

1.4.1 攻毒菌種與人工發(fā)病預(yù)試驗 （1）攻毒預(yù)試：用麥氏比濁法調(diào)整菌液濃度為107、108、109、1010和1011CFU/ml；1日齡蛋公雞180只飼喂至60日齡，隨機均分為6組。空白對照組隔離飼養(yǎng)。其余5組，分別用稀釋的大腸桿菌菌液胸肌注射0.5ml攻毒。每天觀察雞的臨床癥狀，記錄死亡數(shù)，剖檢死亡雞，取病料進行病原分離鑒定。觀察至死亡停止后3d，統(tǒng)計各組的死亡率。確定大腸桿菌的合適攻毒劑量。（2）死亡雞剖檢可見，肝臟腫大質(zhì)脆；肺炎性水腫，有出血點；胃黏膜脫落，胃壁有大小不一的黑褐色潰瘍斑；結(jié)腸、盲腸的漿膜和黏膜充血或出血，腸內(nèi)充滿氣體和膠胨樣物。個別病例肝臟和心臟有局灶性壞死病灶。取病變明顯臟器抹片革蘭氏染色鏡檢為短桿狀、單個散落的紅色細菌。各組死亡率在0~100%之間，因正式試驗時需要觀察用藥效果，死亡率太高不利觀察用藥效果，死亡率太低又不利比較不同劑量的藥物治療效果，所以選擇109CFU/ml菌液濃度(死亡率為36.7%)為正式試驗的攻毒菌液濃度。

1.4.2 試驗動物及分組處理 1日齡羅曼蛋公雞，購自河南省鄭州市正德生物科技有限公司。飼養(yǎng)至60日齡選取250只，均分為5組，每組50只?？瞻讓φ战M隔離飼養(yǎng)，蜂膠提取物預(yù)防組1%蜂膠提取物飲水7d后攻毒，其余3組每羽胸肌注射大腸桿菌液0.5ml攻毒(預(yù)實驗攻毒菌液濃度109CFU/ml)后，蜂膠提取物治療組1%蜂膠提取物飲水，西藥對照組氟苯尼考粉混飼，陽性對照組不用藥。試驗期28天，其中用藥期7d，用藥后觀察21d(表1)。

表1 試驗動物分組處理

1.5 測定指標及方法

1.5.1 臨床癥狀 每日觀察記錄：飲食情況、精神狀況、拉稀狀況、發(fā)病情況、死亡情況。

1.5.2 療效評價標準 結(jié)合生長情況按如下標準綜合判定療效：痊愈：雞只精神活潑，下痢停止，飲食完全正常。顯效：雞只存活，但精神、下痢及飲食等未完全恢復正常。有效率＝(痊愈數(shù)+顯效數(shù))÷樣本數(shù)×100%。

1.5.3 體重變化 試驗前(D0)及試驗結(jié)束(D28)每組3個重復存活雞分別稱重統(tǒng)計增重情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

百分率采用t檢驗，體重變化以Means±SD表示，用SPSS軟件進行Duncan’s多重分析。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌效果

結(jié)果顯示大腸桿菌對蜂膠提取物以及氟苯尼考均高度敏感，抑菌圈直徑高于25mm。蜂膠提取物的MIC為0.013g/m1

表2 抑菌圈直徑（mm）

2.2 總體療效

蜂膠提取物組和西藥對照組死亡率顯著低于陽性對照組(P<0.05)；蜂膠提取物和西藥對照組治愈率和有效率顯著高于陽性對照組(P<0.05)，西藥對照組的治愈率和有效率最高，但與蜂膠提取物組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.3 試驗前后體重變化

在試驗開始D0，各組間體重差異不顯著(P>0.05)。在試驗結(jié)束D28，各攻毒組體重顯著低于空白對照組，蜂膠提取物組顯著高于西藥對照組，西藥對照組顯著高于陽性對照組(P<0.05)(表4)。

表3 各組的總體療效 （%）

表4 各組體重的變化 （g）

3 討論

（1）大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種細菌性傳染病。1885年，Escherich發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌在相當長的一段時間內(nèi)，一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀中葉發(fā)現(xiàn)一些特殊血清的大腸桿菌對人和動物有病原性，才引起人們的重視。目前，已知大腸桿菌的菌體(O)抗原171種，表面(K)抗原接近80種，鞭毛(H)抗原56種，因而構(gòu)成了許多血清型，使動物臨床癥狀表現(xiàn)復雜多樣，且隨著規(guī)模化養(yǎng)畜(禽)業(yè)的發(fā)展，病原性大腸桿菌成了目前養(yǎng)禽業(yè)最棘手的問題。（2）中獸醫(yī)學有著悠久的歷史和豐富的應(yīng)用經(jīng)驗，在抗生素使用以前，對保障家畜健康起著重要作用。國內(nèi)外研究證明，蜂膠提取物具有很強的抗菌作用，有“天然抗生物質(zhì)”之稱[6]。本研究體外藥敏性試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌O78株對蜂膠提取物及氟苯尼考均高度敏感。這表明蜂膠提取物能用于防治大腸桿菌病，這與申慧亭等[7]的研究結(jié)果一致。（3）體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，蜂膠提取物預(yù)防組對雞大腸桿菌的治愈率和有效率稍高于西藥對照組，而蜂膠提取物治療組的治愈率和有效率雖然低于西藥對照組但差異不顯著，表明，蜂膠提取物對雞大腸桿菌病有很好的預(yù)防治療效果。（4）防治大腸桿菌病的關(guān)鍵在于貫徹“養(yǎng)重于防，防重于治”的方針。蜂膠提取物對雞致病性大腸桿菌敏感，療效明顯、安全可靠；此藥為純中藥制劑，具有無毒副作用；用量小，可用于飲水，使用方便等特點，可以用于雞大腸桿菌病的預(yù)防治療。

[1] 周軍, 李紅斌, 李睿鴻. 濫用抗生素對養(yǎng)豬業(yè)的危害及應(yīng)對措施[J]. 當代畜禽養(yǎng)殖業(yè), 2011, 6: 43-46.

[2] 溫偉, 呂金良, 高振偉等. 淺談現(xiàn)代中獸藥的發(fā)展前景[J]. 中獸醫(yī)學雜志, 2010, 1: 50-53.

[3] 李文強, 馬春陽, 軒振等. 植物提取物在家禽抗氧化上的應(yīng)用[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2014(11): 28-33.

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[5] 王效田, 孔祥峰, 夏明龍等. 南京郊區(qū)奶牛乳房炎病原菌分離鑒定

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[6] 張芳英, 穆麗娟, 楊繼章等. 蜂膠提取物的抗菌作用的研究進展[J].中國藥房, 2011(11): 1041-1043.

[7] 申慧亭, 靳月琴. 蜂膠抗菌作用的實驗室研究[J]. 長治醫(yī)學院學報, 2005, 19(4): 253.

S896.6

A

1007-1733(2017)07-0009-03

2017–05–19）

河南牧業(yè)經(jīng)濟學院科技創(chuàng)新團隊（HUAHE2015009），河南省中草藥組培快繁及資源開發(fā)利用創(chuàng)新團隊(C20150033)。

*通訊作者