新疆酸馬奶中乳酸菌的乙醇耐受性及蛋白酶性質(zhì)研究

金 丹,蔣艾廷,喬傳麗,李寶坤

(石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000)

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新疆酸馬奶中乳酸菌的乙醇耐受性及蛋白酶性質(zhì)研究

金 丹,蔣艾廷,喬傳麗,李寶坤*

(石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000)

通過對新疆酸馬奶中乳酸菌以傳統(tǒng)方式分離鑒定后,篩選得到不同種屬菌株,并進(jìn)一步對其乙醇耐受性及蛋白酶活性差別進(jìn)行研究。結(jié)果表明:在分離的21株菌株中,其不同種屬的5株菌株在不同濃度乙醇脅迫12 h后,在耐脅迫能力上,由高到低分別為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),其中最高能夠耐受濃度為13%的乙醇脅迫。對蛋白酶水解能力的測定結(jié)果表明，菌株均能產(chǎn)生蛋白酶,其中乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的水解圈直徑最大,為13.1 mm,其菌株自溶度為36.4%。菌株的乙醇耐受性與其蛋白酶水解能力間無顯著關(guān)聯(lián)性。

酸馬奶,乳酸菌,乙醇,蛋白酶,自溶度

酸馬奶(Koumiss)在新疆、內(nèi)蒙等地區(qū)廣受歡迎,其獨(dú)特的營養(yǎng)保健功效一直被人們所重視[1]。它是經(jīng)乳酸菌等多種微生物共同發(fā)酵而成的低酒精酸性乳飲料[2],酸馬奶有一定的降低血液濃度的功效,并且能夠在一定程度上改善血液循環(huán),控制血液中血脂的含量[3],酸馬奶中含有人體中所必需的金屬離子、維生素及部分微量元素,其中維生素B5的含量比母乳中高出近20倍,維生素C的含量為牛乳的7倍,酸馬奶的高營養(yǎng)價值和良好的醫(yī)用價值與其中乳酸菌的作用密不可分[4]。

乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)是一種原核,無孢子革蘭氏陽性菌,它將一系列碳源主要發(fā)酵成乳酸[5],在食品工業(yè)生產(chǎn)中,LAB主要用于食品和飲料的發(fā)酵及胞外多糖的生產(chǎn)[6],其在食品工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用,主要是作為起始培養(yǎng)物用于許多產(chǎn)品的生產(chǎn)發(fā)酵[7]。然而,作為細(xì)胞工廠,乳酸菌在工業(yè)生產(chǎn)期間及人體的胃腸道中會遇到各類脅迫條件,如酸脅迫、冷脅迫、乙醇脅迫等[8]。通過脅迫作用將會導(dǎo)致菌體存活率或生長速率的降低,且會引起菌體內(nèi)部基因、蛋白質(zhì)或酶活等方面的改變[9]。烏日娜[10]在對乳酸菌的酸脅迫機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌大部分的生長代謝都在低pH的酸性環(huán)境中進(jìn)行,具有酸脅迫反應(yīng)。在發(fā)酵制品中,菌體不可避免的會受到來自外界或內(nèi)部的各種條件的脅迫制約,其中,乙醇脅迫為最常見的因素之一[11]。

乙醇是一種常見的有機(jī)溶劑,會對細(xì)胞及其內(nèi)部組織功能與正常生理代謝活動產(chǎn)生影響[12],Graca da Silveira等[13]研究認(rèn)為,在乙醇濃度為8%～10%(v/v)的條件下,細(xì)菌的生長會受到明顯抑制,由于不同菌株的生理代謝活動均存在不同程度的差異,所以比較不同菌株的差異程度以選取優(yōu)良菌種就十分必要,且菌體中不同酶的活性改變,如蛋白酶,是食品工業(yè)中使用最為廣泛最重要的大分子活性物質(zhì)[14],所以有較高的研究價值。本文主要以新疆巴音溝景區(qū)酸馬奶為樣品,選取不同種屬的乳酸菌進(jìn)行乙醇脅迫后再比較其存活率及蛋白酶性質(zhì),選取最佳耐受菌株,為我國發(fā)酵乳制品提供優(yōu)質(zhì)菌種資源及后續(xù)進(jìn)一步研究菌體內(nèi)部機(jī)理變化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸馬奶 本實(shí)驗(yàn)樣品來源于新疆烏蘇巴音溝景區(qū)。酸馬奶的制備以鮮馬奶為原材料,接種5%的“奶起子”后加以攪拌,在30 ℃條件下發(fā)酵7～10 h后在18 ℃條件下發(fā)酵6 h,再經(jīng)冷卻后即可儲藏食用[4];無水乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7)。

MRS液體培養(yǎng)基[15-16]蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏5.0 g/L,酵母粉5.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,吐溫80 1.0 mL/L,磷酸氫二鉀2.0 g/L,乙酸鈉5.0 g/L,檸檬酸三銨2.0 g/L,硫酸鎂0.58 g/L,硫酸錳0.25 g/L,調(diào)pH為6.2～6.4,于121 ℃滅菌20 min;MRS固體培養(yǎng)基 每1000 mL MRS液體培養(yǎng)基中加瓊脂粉20 g,調(diào)pH6.2～6.4,于121 ℃滅菌20 min;改良MRS培養(yǎng)基 以MRS固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ),加入2%的酪蛋白(干酪素),121 ℃滅菌20 min;生理鹽水 氯化鈉8.5 g定容至1 L,分裝試管后121 ℃滅菌20 min。

SW-CJ-2D雙人單面潔凈工作臺 江蘇蘇潔凈化設(shè)備有限公司;DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;XH-C旋渦混合器 金壇市醫(yī)療儀器廠;LDZX-30KB6立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SL2002N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;GelDoc2000凝膠成像儀 美國伯樂BIO-RAD;Neofuge型高速冷凍離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司;紫外分光光度計 鄭州中譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 將酸馬奶樣品1 mL直接接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下活化24 h,用無菌生理鹽水做10倍梯度稀釋至10-7,而后取三個適當(dāng)稀釋梯度(10-5、10-6、10-7)的100 μL稀釋菌液以同心圓形式涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,待菌落形成穩(wěn)定后,用接種環(huán)挑取分散的單個菌落,以之字形(或井字形)劃線接種于MRS固體平板培養(yǎng)基中,37 ℃條件下培養(yǎng)48 h,此步驟重復(fù)兩次以確保純化菌體。將已經(jīng)分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色與接觸酶實(shí)驗(yàn)后初步判定為乳酸菌再次活化后轉(zhuǎn)接于含甘油及MRS液體培養(yǎng)基的凍藏管中,在-20 ℃下保藏備用。

1.2.2 菌株總DNA提取 采用細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒(離心柱型)提取所篩選菌株的總DNA。取1 mL菌液離心后棄上清,加入180 μL溶菌酶破壁處理后再加入20 μL蛋白酶K混勻。加入220 μL緩沖液與220 μL無水乙醇,充分振蕩后倒入吸附柱,加入500 μL緩沖液后離心棄廢液,加入600 μL漂洗液后離心棄廢液,晾干,加入100 μL洗脫緩沖液靜置后離心,收集溶液即得所需DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 對所篩得全部菌株的16S rDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL,上下游引物各2 μL,DNA 稀釋液2 μL,Mix預(yù)混液 25 μL,ddH2O 19 μL至終體積為50 μL;上游引物為341F(5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3)、下游引物為805R(5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3)。PCR反應(yīng)條件:96 ℃預(yù)變性10 min,35個循環(huán)(95 ℃預(yù)變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其結(jié)果通過凝膠成像儀進(jìn)行觀察。

1.2.4 菌株16S rDNA測序比對 在對經(jīng)PCR擴(kuò)增后的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定,對所擴(kuò)增的16S rDNA序列進(jìn)行測序分析,測序結(jié)果由上海生工生物工程股份有限公司官網(wǎng)下載后經(jīng)NCBI官網(wǎng)中的Nucleotide BLAST中與已知序列進(jìn)行比對,選擇與其相似性最高的已知菌株,對兩者相似性進(jìn)行分析。使用MEGA5軟件中的Neighbor-Joining Tree(鄰接法)以自展值1000來進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立,以判斷菌株間的親緣關(guān)系。

1.2.5 乙醇脅迫后乳酸菌存活率的測定 選取對數(shù)生長末期的菌株分別在培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙醇進(jìn)行脅迫,按2%的接種量選擇以5%為起始濃度[17]開始脅迫,而后以1%濃度梯度逐級增加,脅迫12 h后對菌株進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取適合梯度進(jìn)行涂布培養(yǎng),每個稀釋度做2個平行實(shí)驗(yàn),以國標(biāo)(GB4789.2-94)為標(biāo)準(zhǔn)使用平板計數(shù)法選取最高耐受菌株并對不同濃度下乳酸菌的存活率進(jìn)行測定。根據(jù)公式計算存活率[18]。

存活率(%)=不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫后的活菌數(shù)(CFU/mL)/未添加乙醇的活菌數(shù)(CFU/mL)×100

式(1)

1.2.6 不同菌株的產(chǎn)蛋白酶比較及自溶度的測定 對所篩選出的不同類型菌株先以液體MRS進(jìn)行活化后離心取上清液,在含酪蛋白的MRS培養(yǎng)基中以牛津杯選定區(qū)域后,取上清液15 μL接種量進(jìn)行接種生長,于37 ℃培養(yǎng)24 h,測量菌落產(chǎn)生透明圈的大小[19]。在菌體生長繁殖的過程中,有許多條件都會引起菌體的自溶,如高溫、營養(yǎng)條件改變、pH變化等[20],故對菌體的自溶度進(jìn)行研究也很有必要。離心后的菌液進(jìn)行重懸后使用分光光度計測600 nm處吸光度并計算菌體的自溶度。根據(jù)其公式計算自溶度[21]。

自溶度(%)=100-(A1/A2)×100

式(2)

式(2)中，A1:所測時間內(nèi)最低吸光值;A2:所測時間內(nèi)最高吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Origin進(jìn)行繪圖，使用Excel進(jìn)行繪圖。p<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 基于16S rDNA的耐受乙醇菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA resistant strains of ethanol

2 結(jié)果與分析

2.1 篩菌結(jié)果

在酸馬奶樣品中共篩得21株疑似乳酸菌,并對其進(jìn)行形態(tài)觀察及革蘭氏染色與接觸酶實(shí)驗(yàn),結(jié)果為革蘭氏染色陽性(如圖1所示),接觸酶陰性,則初步判斷所篩菌株為乳酸菌,其中球菌9株,桿菌12株。

圖1 乳酸菌形態(tài)Fig.1 Morphology of lactic acid bacteria注:A:菌落外觀;B:乳酸桿菌;C:乳酸球菌。

2.2 16S rDNA序列分析

2.2.1 16S rDNA分析 在對所篩選出的21株菌株的電泳檢測圖中可以發(fā)現(xiàn),除marker條帶外得到21條清晰的特異性條帶,片段大小均在400～500 bp間,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與目的片段要求相符,電泳圖像如圖2所示。

圖2 菌株16S rDNA電泳圖Fig.2 16S rDNA electrophoresis of strains

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 在對所篩選出的菌株的測序結(jié)果經(jīng)NCBI官網(wǎng)中的Nucleotide BLAST中的已知序列進(jìn)行比對,對兩者相似性進(jìn)行分析。經(jīng)比對后對菌株的種屬進(jìn)行分類,選取不同種屬的12株菌株建立系統(tǒng)發(fā)育樹,使用MEGA5軟件中的Neighbor-Joining Tree(鄰接法),設(shè)置自展值為1000,如圖3所示。

通過比對系統(tǒng)發(fā)育樹可知,17號、18號、19號、21號菌與Pediococcusacidilactici(乳酸片球菌)同源性為99%,即將其鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),20號與Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)同源性為99%,即將其鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus),7號與8號與Lactobacillusfermentum(發(fā)酵乳桿菌)同源性為100%,即將其菌株鑒定為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum),9號、10號與Lactobacillusplantarum(植物乳桿菌)的同源性為100%,即將其菌株鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),1號、2號與22號與Enterococcusfaecium(屎腸球菌)的同源性為98%,即將其菌株鑒定為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。

2.2.3 耐乙醇濃度比較 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%與8%分別為乳酸菌存活率的兩個顯著轉(zhuǎn)折點(diǎn),乙醇濃度在8%時對菌株的生長有明顯的抑制作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與朱敏等[12]的研究相符,乳酸菌的存活率均在乙醇濃度為8%有明顯的抑制。

由表1可知,7號(發(fā)酵乳桿菌,Lactobacillusfermentum)與20號(戊糖片球菌,Pediococcuspentosaceus)菌株可耐受較高濃度乙醇脅迫,除1號(屎腸球菌,Enterococcusfaecium)外,其余4株菌株在5%濃度的乙醇脅迫下存活率均在20%以上,不同菌株間在乙醇脅迫下的存活率存在一定的差異性,且伴隨乙醇濃度的提高,菌株的存活率在逐步降低。5株菌株在耐乙醇脅迫能力上由高到低分別為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),其中發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)為5種菌株中耐受度最高的菌株,能夠耐受濃度為13%的乙醇脅迫,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),菌株對乙醇的耐受度與初始脅迫下的存活率關(guān)系不大,而與菌株種類有一定聯(lián)系。

表1 不同菌種代表菌株乙醇脅迫后存活率Table 1 Survial rate of repre sentative strains under ethand stress

2.2.4 菌株蛋白酶水解情況 菌株能夠水解固體培養(yǎng)基中的酪蛋白,從而產(chǎn)生透明圈,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株的菌落多為乳白色且表面多光滑而有光澤,其在水解能力方面,以18號菌株(乳酸片球菌,Pediococcusacidilactici)的水解圈直徑最大,為13.1 mm,1號菌株(屎腸球菌,Enterococcusfaecium)的水解圈最小,為7.6 mm,如表2所示。

表2 菌株蛋白酶水解情況Table 2 Protease hydrolysis of the strain

乳酸菌菌株的自溶能力會受到多種因素的影響。由圖4可知,5株菌株在自溶能力方面各不相同,因菌株種屬的不同,故存在一定的差異性。其中7號(發(fā)酵乳桿菌,Lactobacillusfermentum)其自溶能力最高,為39.1%,其次為18號(乳酸片球菌,Pediococcusacidilactici)36.4%,除1號菌菌株的自溶能力均在30%～40%之間。各菌株的自溶能力均達(dá)顯著水平(p<0. 05)。菌株機(jī)體的自溶會使部分胞內(nèi)酶釋放,結(jié)合菌株蛋白酶水解情況可以發(fā)現(xiàn),菌株自溶度與蛋白酶的水解能力相關(guān)。

圖4 菌株自溶度比較Fig.4 Self-solubility comparison of strains

3 結(jié)論

于新疆酸馬奶樣品中篩選得到21株乳酸菌菌株,經(jīng)測序比對后主要為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)及屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。對不同種屬的菌株進(jìn)行乙醇脅迫后發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)耐受乙醇濃度最高,均為13%,而后對5株菌株的蛋白酶水解能力進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)菌株均能產(chǎn)生蛋白酶用以水解干酪素,其中乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)水解產(chǎn)生的透明圈直徑最大,為13.1 mm,對菌株自溶度測定后為36.4%。將菌株的乙醇耐受性與其蛋白酶水解能力相結(jié)合后發(fā)現(xiàn),乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)蛋白酶水解能力較強(qiáng)，自溶度較高，但其耐受乙醇濃度不高,故菌株乙醇耐受能力與其蛋白酶活性及其自溶度無顯著關(guān)聯(lián)性。對菌株的深度探索研究,能夠?yàn)槲覈l(fā)酵乳制品提供優(yōu)質(zhì)菌種資源并為后續(xù)進(jìn)一步研究菌體內(nèi)部各類酶活變化情況與基因差異奠定基礎(chǔ)。

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Study on ethanol tolerance and protease properties oflactic acid bacteria from koumiss in Xinjiang areas

JIN Dan,JIANG Ai-ting,QIAO Chuan-li,LI Bao-kun*

(Livestock Laboratory,College of Food Institute,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

The aim of the study was to investigate the ethanol tolerance and the differences of protease activity of different lactic acid bacteria strains,which were isolated and identified traditionally from Xinjiang loumiss.After different concentrations of ethanol stress for 12 h,the results showed the stress tolerance of 5 different strains from high to low wereLactobacillusfermentum,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillusplantarum,Enterococcusfaecium,Pediococcusacidilacticiamong the 21 strains initially isolated,one of the which could withstand the highest concentration of 13% ethanol stress.We concluded that all strains could produce protease by measuring the proteolytic activity of the protease,it was worth mentioning that the diameter of the hydrolytic ring ofPediococcusacidilacticiwas the largest,which was 13.1 mm and the self-solubility was 36.4%.Results have also shown that the relationship between ethanol tolerance and protease hydrolysis was not significant.

kumiss;lactic acid bacteria;ethanol;protease;self-solubility

2016-12-06

金丹(1992-),女,碩士研究生,研究方向:畜產(chǎn)品加工與安全,E-mail:2624576602@qq.com。

*通訊作者:李寶坤(1979-),男,博士,副教授,研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全,E-mail:45205350@qq.com。

國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(31560444)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.025