嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的提取及其生物特性研究

冉軍艦,焦凌霞,梁新紅,何鴻舉,朱明明,盧艷清,趙瑞香

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的提取及其生物特性研究

冉軍艦,焦凌霞,梁新紅,何鴻舉,朱明明,盧艷清,趙瑞香*

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

以嗜酸乳桿菌為研究對(duì)象,通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)和生物學(xué)方法,對(duì)該菌細(xì)菌素產(chǎn)生條件、細(xì)菌素定位和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明:該菌產(chǎn)生細(xì)菌素的最適培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度38 ℃、初始pH7.0、培養(yǎng)時(shí)間18 h;在嗜酸乳桿菌發(fā)酵液中提取的細(xì)菌素具有抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用,主要存在于細(xì)胞外;該菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在40～70 ℃保持較高的活性;在蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后,抑菌活性顯著下降;在pH3.0～10.0之間具有抑菌活性;在紫外照射時(shí)間0.25～1 h之間,活性較穩(wěn)定。此研究結(jié)果對(duì)該菌產(chǎn)細(xì)菌素的分離鑒定及應(yīng)用提供了重要參考。

嗜酸乳桿菌,細(xì)菌素,定位,抑菌活性,穩(wěn)定性

在生活水平越來(lái)越高的今天,人們對(duì)各種食品安全的要求也越來(lái)越高,而各種化學(xué)防腐劑有逐漸被生物活性物質(zhì)取代的趨勢(shì)[1-4]。乳酸菌是公認(rèn)的安全的微生物,常用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)中[5-8]。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬,在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生許多抗菌物質(zhì)[9-10],其中由核糖體合成的細(xì)菌素具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)而成為食品生物防腐劑的熱點(diǎn)[11]。細(xì)菌素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)、來(lái)源、穩(wěn)定性和分子量,目前可以分為五類[12-13]:第一類是含有19～50個(gè)以上的氨基酸殘基的小分子修飾肽的羊毛硫抗生素,分子量小于5 ku[14];第二類是具有膜活性和疏水性的熱穩(wěn)定肽(SHSP),分子量小于10 ku[15];第三類是熱敏感大分子蛋白(LHLP),分子量大于30 ku;第四類是復(fù)合型大分子復(fù)合物;第五類是大多數(shù)大腸桿菌等腸內(nèi)菌所分泌的細(xì)菌素,稱為微菌素或大腸桿菌素[16]。目前研究較深入的大多數(shù)是第一、二類細(xì)菌素,廣泛應(yīng)用到食品防腐保鮮中的是尼生素(Nisin)[17-20]和片球菌素(Pediocin)[21-24],嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素接近于第二類細(xì)菌素[25]。

Lactobacillusacidophilus是由本課題組自行分離保存的一株細(xì)菌,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有較強(qiáng)抑制作用[26],但是對(duì)于該菌產(chǎn)生細(xì)菌素的性質(zhì),本課題組還沒(méi)有系統(tǒng)研究。為了進(jìn)一步研究該菌產(chǎn)生細(xì)菌素的條件和細(xì)菌素的特性,本研究對(duì)Lactobacillusacidophilus細(xì)菌素進(jìn)行了細(xì)菌素產(chǎn)生條件優(yōu)化、定位測(cè)定和穩(wěn)定性的測(cè)定。這對(duì)深入研究Lactobacillusacidophilus的抗菌性,細(xì)菌素進(jìn)行分離、純化和鑒定具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lactobacillusacidophilus由本實(shí)驗(yàn)室自行分離保存;大腸埃希菌(Escherichiacoli)JM109 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；MRS液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1000 mL,微調(diào)pH6.5，用于Lactobacillusacidophilus的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0;固體培養(yǎng)基:固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L)用于EscherichiacoliJM109的培養(yǎng)及乳酸菌活性測(cè)定。

Kendro D-37520高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)sorvall-Heraeus公司;SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺(tái) 蘇州智華凈化精密儀器有限公司;Alpha1-2LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Chirst公司;SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;VCX500超聲波細(xì)胞破碎儀 美國(guó)Sonics & Materials公司;Lambda 25紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵上清液的制備 在50 mL MRS液體培養(yǎng)基中接種Lactobacillusacidophilus,于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行第一次活化,約24 h;將第一次活化的Lactobacillusacidophilus取3%接種到200 mL MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行二次活化,約16～18 h。將活化后的Lactobacillusacidophilus按3%的接種量加入到pH6.2的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,經(jīng)4 ℃低溫下,10000 r/min,15 min離心去沉淀,經(jīng)0.22 μm孔徑無(wú)菌濾膜過(guò)濾后,放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹26]。

1.2.2 細(xì)菌素的提取 本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨鹽析法粗提Lactobacillusacidophilus細(xì)菌素。取100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液,10000 r/min離心20 min,上清在冰浴中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度,置于4 ℃冰箱中過(guò)夜,10000 r/min離心20 min,棄去上清,用磷酸緩沖液(pH6.8)將沉淀懸浮,懸浮液裝入透析袋中(截留量8000～14000 Da)4 ℃充分去鹽后冷凍干燥,溶于1 mL無(wú)菌水測(cè)定抑菌效果[27]。

1.2.3 細(xì)菌素抑菌效果測(cè)定采用牛津杯法測(cè)定:將大腸桿菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,用牛津杯打孔(孔徑6 mm),細(xì)菌素加樣量50 μL/孔,靜置30 min,放入37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后,測(cè)定抑菌圈大小。

抑菌圈直徑(mm)=總直徑(mm)-牛津杯直徑(mm)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次[27]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 在排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫等因素影響的基礎(chǔ)上[28],確定了MRS為產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基,基本發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37 ℃,初始pH7.0,培養(yǎng)時(shí)間18 h,以抑菌圈為指標(biāo),改變1個(gè)因素的水平,其他因素水平不變,考察培養(yǎng)溫度,初始pH和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響。其中培養(yǎng)溫度為31、34、37、40、43 ℃,初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,培養(yǎng)時(shí)間為14、16、18、20、22 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,綜合考慮發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)因素對(duì)Lactobacillusacidophilus產(chǎn)細(xì)菌素活性的影響,采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert8.0建立3因素3水平的Box-Behnken模型,通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定優(yōu)化發(fā)酵條件。以抑菌圈直徑(Y)為響應(yīng)值,培養(yǎng)溫度(X1),初始pH(X2),培養(yǎng)時(shí)間(X3)為自變量,因素編碼水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼值Table 1 Coded table of factors and levels for response surface experiment

1.2.6Lactobacillusacidophilus產(chǎn)細(xì)菌素的定位 根據(jù)優(yōu)化的條件培養(yǎng)Lactobacillusacidophilus得到發(fā)酵液,采用滲透沖擊法進(jìn)行提取[29]:先取發(fā)酵液室溫離心(8000 r/min,5 min)上清液(S1)凍存;沉淀(P1)10 mL(pH6.8)50 mmol·L-1PBS重懸,離心(4 ℃,8000 r/min,10 min),洗滌2次,上清液(S2)凍存;沉淀(P2)以10 mL,25%蔗糖溶液重懸,于25 ℃振蕩10 min,離心(4 ℃,12000 r/min,15 min),上清液(S3)凍存;沉淀(P3)加冷的雙蒸水重懸,在冰水浴中振蕩10 min,離心(4 ℃,12000 r/min,15 min),上清液(S4)凍存;沉淀(P4)重懸于10 mL(pH6.8)50 mmol/L PBS中,在冰浴中超聲波破碎1 min,重復(fù)5次,間隔1 min,再離心(4 ℃,15000 r/min,20 min),上清液(S5)凍存,沉淀(P5)棄去,將S1、S2和S3合并,即為胞外提取液,S4為膜周質(zhì)提取液,S5為膜內(nèi)提取液。取3種提取液,按照1.2.3測(cè)不同處理樣品的抑菌活性,從而得知細(xì)菌素在細(xì)胞中的分布情況。

1.2.7 細(xì)菌素穩(wěn)定性的測(cè)定 熱穩(wěn)定性:將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提液分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃不同溫度條件下水浴處理30 min,在120 ℃的滅菌鍋中靜置30 min,以未經(jīng)高溫處理的粗提液作為對(duì)照,測(cè)定經(jīng)過(guò)不同溫度處理的粗提液的抑菌活性,每個(gè)處理重復(fù)三次[30]。

蛋白酶的穩(wěn)定性:取三份經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的2 mL粗提液,分別加入1 mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K溶液20 μL,37 ℃水浴處理60 min,采用牛津杯法測(cè)定處理后的粗提液的抑菌活性,以加入20 μL PBS緩沖液(pH6.8)處理的粗提溶液作為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)三次[31]。

pH的穩(wěn)定性:將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提溶液分別調(diào)pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,處理12 h后調(diào)節(jié)pH至中性,以未經(jīng)處理的粗提溶液為對(duì)照,采用牛津杯法,測(cè)定不同的pH處理后的粗提液的抑菌活性,每個(gè)處理重復(fù)3次[32]。

紫外線的穩(wěn)定性:將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提液置于30 W紫外光下,距離30 cm,照射0.25、0.5、1、1.5、2 h,以不用紫外光照射的粗提液為對(duì)照,采用牛津杯法,取20 μL檢測(cè)其抑菌活性[32]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

抑菌圈直徑采用十字交叉法測(cè)量,每個(gè)實(shí)驗(yàn)三次重復(fù),采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差,用SPSS(18.0)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,方差分析顯著水平為p=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1Lactobacillusacidophilus的抑菌效果

Lactobacillusacidophilus發(fā)酵培養(yǎng)液抑菌活性測(cè)定結(jié)果如圖1所示,和對(duì)照相比,樣品作用于大腸桿菌均有明顯的抑菌圈,說(shuō)明Lactobacillusacidophilus可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì),對(duì)大腸桿菌具有較好的抑菌作用。

圖1 菌液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of fermentation broth on Escherichia coli注:a. 抑菌物質(zhì);b. CK。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌效果的影響 從圖2可以看出,在溫度31～43 ℃范圍內(nèi),抑菌圈直徑隨著溫度的升高增大后減小,在低于37 ℃時(shí),抑菌圈直徑的增加有顯著性差異,而在高于37 ℃時(shí),抑菌圈直徑?jīng)]有顯著增加,在43 ℃時(shí)有下降的趨勢(shì),可能是抑菌物質(zhì)在溫度較高時(shí)會(huì)部分失活[33],因此,培養(yǎng)溫度選擇34～40 ℃之間為宜。

圖2 溫度對(duì)抑菌效果的影響Fig.2 Effect of temperature on antagonistic effect

2.2.2 初始pH對(duì)抑菌效果的影響 由圖3可知,在初始pH5.0～9.0范圍內(nèi),抑菌圈直徑隨著初始pH的升高先增大后減小,在初始pH高于7.0后,抑菌圈直徑隨著初始pH的升高而降低,不同于大多數(shù)乳酸菌在弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng),說(shuō)明細(xì)菌素的產(chǎn)生是菌株對(duì)不良環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[33]。因此,選擇初始pH6.0～8.0之間較好。

圖3 初始pH對(duì)抑菌效果的影響Fig.3 Effect of initial pH on antagonistic effect

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響 由圖4可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌圈直徑逐漸增大并趨于穩(wěn)定,其中在18 h內(nèi),抑菌圈直徑的增大有顯著性差異,而在18 h后,抑菌圈直徑基本保持不變,已經(jīng)趨于穩(wěn)定,說(shuō)明該菌發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)已達(dá)到最高值,而且培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使部分抑菌物質(zhì)失活或者被菌體吸附[32],所以綜合考慮,選擇培養(yǎng)時(shí)間16～20 h。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響Fig.4 Effect of time on antagonistic effect

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 按照表1設(shè)計(jì)的因素水平,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)Lactobacillusacidophilus發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究,結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface design and corresponding response values

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Significant test of regression equation coefficient

表4 響應(yīng)面模型的方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for response surface model

表3的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,R2(決定系數(shù))為0.9917表示該模型能夠解釋99%的響應(yīng)值變化,失擬項(xiàng)不顯著說(shuō)明該模型擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差小。模型p=0.0001表明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)模型為顯著模型。

從表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,在p=0.05顯著水平,模型一次項(xiàng)X1、X2和X3都顯著;交互項(xiàng)X1X2顯著,X1X3和X2X3不顯著;二次項(xiàng)X12和X32顯著,X22不顯著。各因素對(duì)抑菌活性的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,利用軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二元回歸分析,得到各因子對(duì)抑菌圈直徑(Y)影響的二次多項(xiàng)回歸模型:

Y=-378.94+12.37X1+17.65X2+9.05X3-0.25X1X2-0.03X1X3-0.12X2X3-0.13X12-0.33X22-0.19X32

2.3.2 響應(yīng)面雙因素交互分析 二階回歸模型的響應(yīng)面和等高線圖分別見(jiàn)圖5～圖7,通過(guò)圖中因素對(duì)響應(yīng)值的直觀分析,可以對(duì)兩因素間的交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià),并根據(jù)回歸方程求出優(yōu)化工藝條件。

在培養(yǎng)時(shí)間為18 h的條件下,培養(yǎng)溫度和初始pH的交互作用結(jié)果顯示最優(yōu)值分別是培養(yǎng)溫度37 ℃,初始pH為7,抑菌圈直徑達(dá)到最大值14.45 mm(圖5),在培養(yǎng)溫度一定的條件下,抑菌圈直徑隨著pH的增加而增大,當(dāng)pH接近8時(shí),抑菌圈直徑增加緩慢;在pH一定的條件下,抑菌圈的直徑隨著溫度的升高而增大,當(dāng)溫度超過(guò)38 ℃后,繼續(xù)升高溫度,抑菌圈直徑呈下降趨勢(shì),且后者的下降變化速率比前者上升的變化速率更快。從等高線圖可以看出,響應(yīng)值對(duì)培養(yǎng)溫度的變化比對(duì)初始pH的變化更為敏感,兩者的交互作用極為顯著。

圖5 培養(yǎng)溫度和初始pH對(duì)抑菌圈直徑的 交互作用響應(yīng)面模型Fig.5 Response surface model plot showing the effects of temperature and initial pH on antagonistic diameter

圖6 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的 交互作用響應(yīng)面模型Fig.6 Response surface model plot showing the effects of temperature and time on antagonistic diameter

在pH為7的條件下,培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用結(jié)果顯示最優(yōu)值分別是培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)時(shí)間18 h,抑菌圈直徑達(dá)到最大值14.61 mm(圖6),在培養(yǎng)溫度一定的條件下,抑菌圈直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)18 h后,再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間抑菌圈直徑反而下降,但是后者下降的變化速率比前者上升的變化速率明顯要慢;在培養(yǎng)時(shí)間一定的條件下,抑菌圈的直徑隨著培養(yǎng)溫度的升高而增大,當(dāng)溫度超過(guò)38 ℃后,繼續(xù)升高溫度,抑菌圈直徑呈下降趨勢(shì),后者的下降變化速率和前者上升的變化速率相當(dāng)。從等高線圖可以看出,響應(yīng)值對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的變化比對(duì)培養(yǎng)溫度的變化更為敏感,但兩者的交互作用不顯著。

在培養(yǎng)溫度為37 ℃的條件下,初始pH和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用結(jié)果顯示最優(yōu)值分別是初始pH為7,培養(yǎng)時(shí)間18 h,抑菌圈直徑達(dá)到最大值14.61 mm(圖7),在初始pH一定的條件下,抑菌圈直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)18 h后,再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,抑菌圈直徑反而下降,但是后者下降的變化速率比前者上升的變化速率明顯要慢;在培養(yǎng)時(shí)間一定的條件下,抑菌圈的直徑隨著初始pH的升高而增大,當(dāng)pH超過(guò)7后,繼續(xù)增加pH,抑菌圈直徑呈下降趨勢(shì),后者下降的變化速率比前者上升的變化速率更快。從等高線圖可以看出,響應(yīng)值對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的變化比對(duì)初始pH的變化更為敏感,兩者的交互作用不顯著。

圖7 初始pH和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的 交互作用響應(yīng)面模型Fig.7 Response surface model plot showing the effects of initial pH and time on antagonistic diameter

2.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)design expert 8.0優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度38.13 ℃,初始pH為7.00,培養(yǎng)時(shí)間17.87 h,抑菌圈直徑最大值為16.47 mm。結(jié)合實(shí)際情況,可將培養(yǎng)溫度38 ℃,初始pH為7,培養(yǎng)時(shí)間18 h作為實(shí)際操作的工藝參數(shù)。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件重復(fù)進(jìn)行五次實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表5所示,標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,可以進(jìn)行下一步應(yīng)用。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 5 Verification test

2.4Lactobacillusacidophilus產(chǎn)細(xì)菌素的定位

Lactobacillusacidophilus菌體不同部位抑菌活性測(cè)定結(jié)果如圖8所示,胞外提取液的抑菌活性最高,其次是周質(zhì)空間,而胞內(nèi)提取液幾乎沒(méi)有抑菌活性,說(shuō)明Lactobacillusacidophilus菌體在胞內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)菌素為可溶性物質(zhì),大部分分泌到了胞外培養(yǎng)液中,由此確定Lactobacillusacidophilus產(chǎn)的細(xì)菌素為胞外酶。

圖8 Lactobacillus acidophilus產(chǎn)細(xì)菌素定位Fig.8 Bacteriocin localization of Lactobacillus acidophilus

2.5Lactobacillusacidophilus產(chǎn)細(xì)菌素的穩(wěn)定性

2.5.1 對(duì)熱的穩(wěn)定性 將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提液分別在不同的溫度條件下進(jìn)行處理,以未經(jīng)溫度處理的粗提液作為對(duì)照,不同溫度處理的粗提液的抑菌活性如圖9所示。

圖9 溫度對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響Fig.9 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by different temperature

從圖9可以看出,Lactobacillusacidophilus產(chǎn)生的細(xì)菌素受溫度的影響較大,當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí),雖然隨著溫度升高該細(xì)菌素質(zhì)抑菌活性有所下降,但沒(méi)有顯著性差異,總體上比較穩(wěn)定;在溫度達(dá)到80 ℃時(shí),細(xì)菌素質(zhì)的抑菌活性大幅下降,與之前的抑菌活性相比有顯著性差異;當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)細(xì)菌素失去活性,說(shuō)明該細(xì)菌素質(zhì)有很好的熱穩(wěn)定性。

2.5.2 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性 取三份經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提液分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K溶液進(jìn)行處理,后測(cè)定其抑菌活性,以加入20 μL PBS緩沖液(pH6.8)處理的粗提液作為對(duì)照,測(cè)定結(jié)果如圖10所示。

圖10 蛋白酶對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響Fig.10 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by different proteinase

從圖10可以看出,經(jīng)蛋白酶處理后的粗提液與未經(jīng)蛋白酶處理的粗提液相比,抑菌活性明顯下降,有顯著性差異,特別是蛋白酶K的影響最大,說(shuō)明該細(xì)菌素對(duì)蛋白酶敏感。

2.5.3 對(duì)pH的穩(wěn)定性 將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提液分別用不同pH處理,以未經(jīng)處理的粗提液為對(duì)照,測(cè)定不同的pH處理后的粗提液的抑菌活性,結(jié)果如圖11所示。

圖11 pH對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響Fig.11 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by different pH

從圖11可以看出,細(xì)菌素的抑菌活性受pH的影響很大,該細(xì)菌素在中性條件下比較穩(wěn)定,在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下抑菌活性顯著下降,與中性條件下的抑菌活性相比有顯著性差異,在pH達(dá)到10.0以上或者3.0以下失去抑菌活性,說(shuō)明該細(xì)菌素的活性pH范圍很廣。

2.5.4 對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的粗提液置于紫外光下,距離30 cm,照射不同時(shí)間進(jìn)行處理,以不用紫外光照射的粗提液為對(duì)照,測(cè)定其抑菌活性,結(jié)果如圖12所示。結(jié)果表示,隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng),粗提液的穩(wěn)定性受到影響,經(jīng)過(guò)差異性分析發(fā)現(xiàn)紫外照射超過(guò)1 h其抑菌活性有顯著性降低。

圖12 紫外線對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響Fig.12 Inhibitory activity of the bacteriocin treated by ultraviolet irradiation

3 結(jié)論

乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的多肽類的抑菌物質(zhì),具有無(wú)毒、高效、耐酸、耐高溫等特點(diǎn),可用來(lái)代替化學(xué)防腐劑應(yīng)用于食品保鮮。本課題組保存的一株Lactobacillusacidophilus所產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌有很好的抑制作用,在MRS培養(yǎng)基中,Lactobacillusacidophilus產(chǎn)生細(xì)菌素的最適條件為培養(yǎng)溫度38 ℃,初始pH7.0,培養(yǎng)時(shí)間18 h,抑菌圈直徑為16.47 mm,在此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為16.21 mm,相對(duì)偏差小,說(shuō)明該工藝條件穩(wěn)定。通過(guò)硫酸銨鹽析對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)菌素進(jìn)行提取,發(fā)現(xiàn)沉淀有抑菌作用,初步可以斷定為蛋白類物質(zhì),且通過(guò)定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素大部分存在于細(xì)胞外。細(xì)菌素在40～90 ℃有活性,具有良好的熱穩(wěn)定性;在蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后,抑菌活性大大降低;在pH3.0～10.0之間具有抑菌活性;紫外照射時(shí)間超過(guò)1 h,其抑菌活性有顯著性的減低。本研究對(duì)于Lactobacillusacidophilus產(chǎn)生的細(xì)菌素的分離、純化和鑒定等后續(xù)工作奠定了理論基礎(chǔ)。

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Extraction of bacteriocin produced byLactobacillusacidophilusand biology characteristic analysis

RAN Jun-jian,JIAO Ling-xia,LIANG Xin-hong,HE Hong-ju,ZHU Ming-ming,LU Yan-qing,ZHAO Rui-xiang*

(Henan Institute of Science and Technology,School of Food Science,Xinxiang 453003,China)

Response surface methodology was used to optimize the conditions for producing bacteriocin,biological methods was applied for localization of bacteriocin and the stabilization of bacteriocin ofLactobacillusacidophilus. Results showed that the optimal bacteriocin production forLactobacillusacidophiluswere:38 ℃,pH7.0 and 18 hours in MRS medium.Lactobacillusacidophilusfermentation broth could inhibit the growth ofEscherichiacoliwhich was mainly in the extracellular extracts. The bacteriocin had good heat stability under 40～70 ℃. The inhibitory activity was decreased by the treatment with proteinase K,pepsin and trysin. The active pH of the bacteriocin to the pathogen was from 3.0 to 10.0. The inhibitory activity was stable with the time of ultraviolet irradiation 0.25～1 h. These results may provide an important reference for separation and application of bacteriocin produced byLactobacillusacidophilus.

Lactobacillusacidophilus;bacteriocin;localization;antimicrobial activity;stability

2016-12-27

冉軍艦(1981-)，男，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)的研究，E-mail：ranjunjian@126.com。

*通訊作者:趙瑞香(1966-)，女，博士，教授，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)因子的研究，E-mail：zhaoruixiang103@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31401673)；河南科技學(xué)院高層次人才科研項(xiàng)目(2015016)；河南科技學(xué)院科技創(chuàng)新基金(2015006)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0112-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.021