全自動熒光原位雜交儀實驗條件的優(yōu)化及與手工方法的對比

陳 敏，楊潔亮，呂麗霞，陳華容，唐 源

全自動熒光原位雜交儀實驗條件的優(yōu)化及與手工方法的對比

陳 敏，楊潔亮，呂麗霞，陳華容，唐 源

全自動雜交儀；熒光原位雜交；石蠟包埋組織樣本

近年來，熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)廣泛應(yīng)用于分子靶向治療、腫瘤診斷、鑒別診斷以及腫瘤預(yù)后評估方面[1]。FISH技術(shù)通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交。在熒光顯微鏡下觀察并分析細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA靶序列的探針信號，以獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體(或染色體片段)上基因狀態(tài)的信息[2]。本科室自2010年開展FISH檢測臨床工作以來，每年完成約2 000例/2500項基因的FISH檢測工作。包括乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、軟組織腫瘤等石蠟包埋組織樣本及新鮮血液和尿液樣本。積累了較多的FISH實驗操作和閱片經(jīng)驗。近期，我科室引進(jìn)兩套徠卡全自動熒光原位雜交儀Leica S600(ThermoBrite Elite, TBE)及操作系統(tǒng)。為了驗證全自動熒光原位雜交儀的實用性，本實驗選取了120例石蠟包埋實體瘤組織樣本摸索TBE實驗條件，并比較其與手工方法的差異。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年4月四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科存檔的浸潤性乳腺癌組織樣本40例；肺癌、淋巴瘤、軟組織腫瘤及神經(jīng)腫瘤石蠟包埋樣本各20例，共計120例。

1.2 儀器試劑 TBE系統(tǒng)，熒光顯微鏡Leica DM600，AI 4.0采圖系統(tǒng)，Abbott ThermoBrite原位雜交儀，水浴鍋，離心機(jī)。

FISH探針包括：乳腺癌Pathvysion HER-2探針，肺癌ALK與ROS1雙色分離探針；淋巴瘤BCL-2、BCL-6、c-myc雙色分離探針；神經(jīng)腫瘤1P19Q缺失探針；軟組織腫瘤MDM2擴(kuò)增探針、SS18雙色分離探針(所有探針均購自Abbott Vysis公司)。胃蛋白酶(購自Sigma公司)，鹽酸，檸檬酸，SSC，NP-40，環(huán)保脫蠟劑，各濃度梯度乙醇。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 每例石蠟包埋組織連續(xù)切片，準(zhǔn)備5張4 μm厚防脫切片，其中2張進(jìn)行TBE雜交，1張手工雜交，1張常規(guī)HE染色，1張備用。65 ℃過夜烤片。

1.3.2 手工方法 (1)環(huán)保脫蠟劑脫蠟1 h，乙醇梯度復(fù)水。(2)預(yù)處理：高溫高壓4 min(電磁爐中功率加熱，噴氣后計時4 min，氣壓為2個大氣壓，鍋內(nèi)溫度120 ℃左右)。(3)消化：0.1 mg/mL胃蛋白酶37 ℃消化12～25 min。(4)0.2 mol/L鹽酸5 min，梯度乙醇脫水，自然干片。(5)雜交變性：85 ℃變性5 min，45 ℃雜交過夜。(6)清洗：0.3%NP-40/0.4×SSC 72 ℃洗片2 min；0.1%NP-40/2×SSC室溫2 min；2×SSC室溫2 min。(7)復(fù)染：滴加15 μL DAPI復(fù)染后蓋上蓋玻片，暗處放置15 min后鏡下觀察。

1.3.3 TBE方法 TBE主要參數(shù)：共分為3個小缸，每缸可放4張切片，單張可放12張切片，背靠背最多可做24張切片。放12張切片時，進(jìn)液量為164%；24張時，進(jìn)液量為200%。切片架的擺動頻率為12次/分。常規(guī)增設(shè)管道及切片的沖洗，梯度升降溫。除人工滴加探針并進(jìn)行封片外，所有步驟均在機(jī)器上完成。胃蛋白酶及其他所有試劑的配制、變性雜交以及清洗的步驟均與手工方法一致。TBE選取兩種預(yù)處理方法，分別為蒸餾水與10 mmol/L pH 6.0檸檬酸95 ℃處理30 min。消化時間：乳腺癌消化15 min；肺癌、淋巴瘤及神經(jīng)類腫瘤消化18 min；軟組織腫瘤樣本消化25 min。

1.4 質(zhì)控及評價標(biāo)準(zhǔn)[1]手工與TBE每輪實驗均增加1張經(jīng)FISH驗證的陽性對照石蠟組織。陰陽性信號正常，染色背景低，細(xì)胞核輪廓清晰可見，≥75%的細(xì)胞可見清晰的紅綠信號。采用雙盲法判讀，將雜交結(jié)果標(biāo)記為“成功”與“失敗”進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

TBE與手工方法的合格率均>90%，TBE系統(tǒng)雜交背景低于手工染色(圖1、2)。TBE兩種預(yù)處理方法合格率與手工方法接近(表1)。其中去離子水預(yù)處理的合格率為90.8%(109/120)，低于檸檬酸93.3%(112/120)的結(jié)果。此兩種預(yù)處理方法的雜交效果在淋巴瘤及神經(jīng)腫瘤樣本上無差異，均全部成功。在處理乳腺癌、肺癌及軟組織腫瘤時，去離子水預(yù)處理切片的合格率稍低于檸檬酸。手工方法的合格率為91.7%，在處理乳腺癌HER-2基因及軟組織腫瘤類基因時的雜交效果優(yōu)于TBE；而在肺癌、淋巴瘤及神經(jīng)類樣本中的合格率稍低于TBE。

表1 TBE與手工方法結(jié)果對比

3 討論

FISH技術(shù)在臨床病理診斷、鑒別診斷及靶向治療方面應(yīng)用廣泛。石蠟包埋組織FISH檢測的關(guān)鍵步驟包括前期的預(yù)處理和酶消化[2-3]。預(yù)處理方法多樣，有商品化的預(yù)處理試劑盒、水煮[4]、高溫高壓[5]、檸檬酸[6]等。預(yù)處理主要是通過物理或化學(xué)作用，解除甲醛包埋過程中形成的交聯(lián)，有效的暴露細(xì)胞核，便于探針進(jìn)入。本實驗使用TBE系統(tǒng)與手工方法對常規(guī)石蠟包埋組織乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、神經(jīng)腫瘤及軟組織腫瘤樣本行FISH實驗。選取去離子水與10 mmol/L pH6.0檸檬酸兩種預(yù)處理方法進(jìn)行TBE機(jī)染，合格率分別為90.8%、93.3%。檸檬酸效果略優(yōu)于去離子水，可能與檸檬酸的化學(xué)和酸作用相關(guān)[6]。TBE系統(tǒng)與手工方法(91.7%)的合格率接近。手工方法使用高溫高壓去離子水煮4 min，簡單易行無需配制試劑，可廣泛推廣。

在胃蛋白酶消化方面：乳腺癌、肺癌與淋巴瘤組織細(xì)胞密度大，腫瘤細(xì)胞常呈巢團(tuán)狀，比較容易消化[7]，一般消化15～18 min。軟組織腫瘤樣本如脂肪相關(guān)腫瘤，細(xì)胞密度低，常伴有脂肪空泡，黏液或者出血壞死以及鈣化等成分，比較難消化，可適當(dāng)延長消化時間，一般消化25～30 min。而TBE系統(tǒng)不能針對每一樣本單獨調(diào)節(jié)消化時間，每缸必須運行統(tǒng)一的消化時間。手工方法可以針對每一樣本，根據(jù)經(jīng)驗結(jié)合組織形態(tài)，通過明場顯微鏡觀察后，選擇合適的消化時間。因而手工方法在處理軟組織腫瘤樣本的合格率高于TBE染色。

TBE前期處理時間2 h左右，每天機(jī)器可反復(fù)使用[8]，環(huán)保高效。由于FISH實驗中探針價格昂貴，此機(jī)器未實現(xiàn)探針滴加的自動化，必須手工滴加探針并封片，未能做到全封閉。

注意事項：上機(jī)前仔細(xì)檢查各試劑管道接口是否正確，試劑量是否足夠，切片是否安放正確，檢查廢液桶排空情況等。酶消化液現(xiàn)配現(xiàn)用，未使用完的酶消化液必須及時清理防止長菌，污染管道。除酶外的試劑，短時間內(nèi)可常溫放置。定期保養(yǎng)和清洗管道和染色缸，以免堵塞而影響機(jī)器的正常使用。在染色過程中密切觀察機(jī)器的運行情況，遇到問題及時解決，并用專用記錄本登記。

①A①B①C②A②B②C

圖1 TBE檸檬酸預(yù)處理c-myc基因雜交結(jié)果，分別為單通道紅色(A)、綠色(B)及重疊圖(C):可見紅綠信號背景較低，很容易區(qū)分信號 圖2 手工方法高溫高壓預(yù)處理c-myc基因雜交結(jié)果；分別為單通道紅色(A)、綠色(B)及疊加圖(C):可見手工方法紅綠信號背景較高(白色箭頭)，三通道下可見一些雜信號(黑色箭頭)，影響判讀

TBE從質(zhì)量、速度、穩(wěn)定性等諸多方面，實現(xiàn)了病理檢查結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，為臨床診斷提供可靠的參考依據(jù)。

[1] 《乳腺癌HER-2檢測指南》編寫組. 乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2014,43(4):262-267.

[2] 關(guān)丹丹, 宮麗平. 石蠟組織FISH檢測的關(guān)鍵技術(shù)點分析[J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育, 2016,34(6):86-88.

[3] 倪燦榮, 鄭建民. HER-2基因原位雜交方法學(xué)探討[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2013,20(8):495-497.

[4] 徐明堂, 何春年, 趙煥芬. 高壓高溫預(yù)處理后FISH法檢測子宮頸病變組織中hTERC基因[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2011,27(6): 665-667.

[5] 陳 潔, 張科平, 劉艷輝. 水煮預(yù)處理法在胃癌石蠟切片F(xiàn)ISH實驗中的應(yīng)用[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2012,28(12):1411-1443.

[6] Chin S F, Daigo Y, Huang H E,etal. A simple and reliable pretreatment protocol facilitates fluorescent in situ hybridization on tissue microarrays of paraffin wax embedded tumor samples[J]. Mol Pathol, 2003,56(12):275-279.

[7] 陳順平. FISH中酶消化細(xì)胞的幾點體會[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2010,26(1):16.

[8] 陳 艷, 潘美華. 全自動免疫組化儀與手工操作應(yīng)用體會[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2015,25(6):708-709.

時間：2017-6-20 11:19 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.026.html

四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，成都 610041

陳 敏，女，碩士研究生。Tel: (028)85422643，E-mail: 39005388@qq.com 唐 源，女，副主任技師，通訊作者。E-mail: 1202ty@163.com

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1001-7399(2017)06-0694-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.026

接受日期：2017-02-13