蒙、漢族兒童原發(fā)性腎病綜合征TIM-3 基因及IFN-γ檢測的意義

黃金月郭妍妍趙 蕓

1.天津市兒童醫(yī)院 第二兒童醫(yī)院兒內(nèi)科（天津 300134）；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科（內(nèi)蒙古呼和浩特 010059）

蒙、漢族兒童原發(fā)性腎病綜合征TIM-3 基因及IFN-γ檢測的意義

黃金月1郭妍妍2趙 蕓2

1.天津市兒童醫(yī)院 第二兒童醫(yī)院兒內(nèi)科（天津 300134）；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科（內(nèi)蒙古呼和浩特 010059）

目的研究TIM-3基因多態(tài)性及γ干擾素（IFN-γ）水平與兒童原發(fā)性腎病綜合征（PNS）發(fā)病的相關(guān)性。方法 采用病例對照研究，選取漢族PNS患兒21例，蒙古族（祖籍三代以上均為蒙古族）、漢族（祖籍三代以上均為漢族）健康體檢各20例為對照組；采用PCR-限制性片段多態(tài)性分析方法，分析檢測PNS患兒和對照組的T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（TIM-3）基因外顯子－574A/C的單核苷酸多態(tài)性，比較基因型及等位基因頻率；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血IFN-γ水平，并分析其變化。結(jié)果漢族和蒙古族正常對照組之間TIM-3基因外顯子－574A/C位點基因型（AA、AC、CC）分布差異無統(tǒng)計學意義（P=0.741）；兩組間等位基因頻率差異也無統(tǒng)計學意義（P=0.655）。將漢族和蒙古族正常對照組合并與漢族PNS患兒進行比較，漢族PNS患兒－574A/C位點AA、AC和CC基因型頻率分別為9.52%、28.57%和61.90%，與40例正常對照組兒童的基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017）；漢族PNS患兒的C等位基因頻率為76.2%，高于正常對照組（50.0%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005），與A等位基因個體比較，C等位基因攜帶者兒童發(fā)生PNS的風險增加3.20倍（95%CI：1.39～7.37）。漢族PNS、漢族以及蒙古族正常對照組之間血清IFN-γ水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論TIM-3基因外顯子-574A/C的單核苷酸多態(tài)性可能與兒童PNS的發(fā)病相關(guān)；IFN-γ與兒童原發(fā)性腎病綜合征的發(fā)病無明顯相關(guān)性。

腎病綜合征； 基因多態(tài)性； 兒童

兒童原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS），是在多重因素作用下，引起腎小球的濾過膜發(fā)生異常，對血漿成分的通透性變化，主要表現(xiàn)為對蛋白通透性增加或電荷屏障破壞后，出現(xiàn)大量蛋白從尿中流失，導致血漿蛋白水平下降，機體出現(xiàn)局部或全身性水腫，合并血脂增高為特征的一種臨床癥候群。研究證實，PNS患兒Th1/Th2免疫應答失調(diào)，活化的Th1細胞表面可檢測到T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T-cell immunoglobulin and mucin domaincontaining protein 3，TIM-3）的相應表達，受體與其特異性結(jié)合，Th1型介導的效應細胞分化抑制，而Th2細胞出現(xiàn)相應程度的增高，自身機體的免疫功能出現(xiàn)異常，調(diào)節(jié)功能同樣受到明顯阻滯，出現(xiàn)以Th2細胞介導的免疫反應為主的現(xiàn)象，發(fā)生免疫性遷移/失衡[1]。已有研究證明TIM-3與過敏性鼻炎，變應性哮喘及多發(fā)性硬化癥等疾病的發(fā)生相關(guān)[2,3]，TIM-3與其配體（TIM-3L）結(jié)合，對Th1細胞產(chǎn)生抑制性信號，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，從而抑制炎癥反應，降低自身免疫應答能力，緩解疾病的發(fā)展。目前腎病綜合征的發(fā)病機制尚不明確。有大量的研究證明，發(fā)病機制與免疫異常密切相關(guān)，尤其是T淋巴細胞異常參與該疾病的發(fā)病[4,5]。本研究擬探討TIM-3基因在－574A/C位點的差異及所分泌的相關(guān)的細胞因子干擾素（IFN）-γ與兒童PNS的發(fā)病機制的相應關(guān)系，并且針對所在地內(nèi)蒙古自治區(qū)的民族特異性，對比蒙、漢族民族之間差異，了解民族差異是否影響該疾病的發(fā)生率，進一步為治療提供新思路，為疾病遺傳易感性完善相應的基因數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年5月至2015年10月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院住院的腎病綜合征患兒為病例組。病例組入選標準：①年齡3～12歲；②符合腎病綜合征診斷標準[6]，入院前未用過腎上腺皮質(zhì)激素等免疫抑制劑治療，病程1～2周，初發(fā)病例；③排除繼發(fā)性疾病引起的腎病綜合征，無高血壓和腎功能嚴重損害，無肝功能異常，無合并感染性疾病或其他免疫性疾病。

健康對照組，分別設蒙古族和漢族正常對照組。入選標準：①內(nèi)蒙古自治區(qū)中西部地區(qū)，相互間無血緣關(guān)系，無與其他異族通婚的蒙古族和漢族兒童，蒙古族兒童祖籍三代以上均為蒙古族，漢族兒童祖籍三代以上均為漢族；②年齡2～14歲；③與病例組同地區(qū)、同時期；④無特殊免疫性疾病史的常規(guī)體檢健康兒童。

本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試對象及其家屬均告知病情及簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因多態(tài)性檢測 取2 mL靜脈血，EDTA抗凝，以經(jīng)典酚-氯仿法[7]完成白細胞基因組DNA的提取。TIM-3基因外顯子區(qū)－574 A/C基因多態(tài)性分析：應用3730毛細管電泳分析法以及PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PCR-PAGE）分析方法[8]。參考文獻[4]設計引物－574A/C（F1：5’-GGA ACA CAA CAG TGA ATG GC-3’；R1：5’-GGA TGA GAG TGA GGC TTA TG-3’（瀚宇生物工程有限公司）。PCR總反應體系10 μL，包括模板DNA 1 μL，濃度為2 pmol/μL，Taq DNA ligas（eTaq DNA聚合酶）0.05 μL，濃度為2 U，1.5 μL 5×PCR緩沖液，不足體積用去離子水補充。熱循環(huán)條件：95℃預變性2 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，40個循環(huán)，最后65℃延伸10 min，取4 μL PCR的相應所得基因片段產(chǎn)物，在其內(nèi)添加限制性內(nèi)切酶1 μL，保持在水浴箱內(nèi)靜置，溫度維持在37℃，應用酶切約4 h，然后以20 g/L 3%瓊脂糖凝膠，80V電壓下電泳30 min，觀察PCR產(chǎn)物效果，從而明確其作為模板在連接酶檢測反應（ ligase detection reaction，LDR）中加入的量。3730毛細管電泳圖觀察各基因型的分布及相應的峰值，用Gene mapper完成圖像及標本采集[8]。對所有單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行方案分配。所應用的目的基因探針序列：rs10515746-modify，5'-ATG GTC TGT AAA TGT GAG GAT TTT TTC GCA AAC CTG TAC TC-3'，rs10515746-A，5'-TTT TGA GGC TTA TGC TGG GAG TTG CT-3（'82bp），rs10515746-C，5'-TTT TTT GAG GCT TAT GCT GGG AGT TGCG-3'(84 bp)。

1.2.2 血清IFN-γ的測定 采用ELISA方法檢測（試劑盒購自美國ENDOGEN公司）。以血清IFN-γ濃度＜0.87pg/mL作為低濃度標準[9]。將置于－80℃冰箱凍存的人血清按照ELISA試劑盒說明進行操作，完成試驗過程。停止實驗的反應過程，用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值（OD值）。以OD值作為橫坐標，將標準物濃度作為縱坐標，計算出相應標準曲線的多項式二次回歸方程，并將樣品OD值代入方程式中，計算樣品濃度，然后乘以相應被稀釋后的倍數(shù)，由此可以得出被檢測樣品的實際濃度[9]。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。偏態(tài)分布計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)范圍表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗，基因型對兒童PNS的相對危險度以優(yōu)勢比（odds ratio，OR）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

病例組21例，男10例、女11例，中位年齡5.5歲（3.8～10.5歲）。正常對照組40例，男19例、女21例，中位年齡5.0歲（4.0～9.5歲）；其中漢族正常對照組20例，男10例、女10例，中位年齡5.0歲（3.5～10.0歲），蒙古族正常對照組20例，男9例、女11例，中位年齡5.4歲（4.2～9.3歲）。病例組與漢族、蒙古族正常對照組的年齡和性別的差異無統(tǒng)計學意義（H=5.31，χ2=0.10，P均＜0.05）。

2.2 基因型檢測結(jié)果

TIM-3基因外顯子－574A/C位點的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后產(chǎn)物獲得3種相應的基因型，其中雜合子AC基因型，可見83.25 bp和85.10 bp 2個基因型片段；AA基因型可見83.14 bp 1個片段；而CC基因型有85.07 bp 1個基因片段。應用3730毛細管電泳及Gene mapper分析基因型測序[8]發(fā)現(xiàn)，TIM-3基因外顯子－574A/C位點測序圖中得到純合子AA基因型和純合子CC基因型各有1個峰，為A峰、C峰，雜合子AC有2個峰圖，A峰和C峰。見圖1。

2.3TIM-3外顯子區(qū)域－574A/C位點基因多態(tài)性及等位基因的頻率分布

有關(guān)糖尿病與LA以及兩者導致認知損害的臨床研究主要包括影像學，電生理，神經(jīng)心理學以及LA形成的高危因素等方面。從目前的研究現(xiàn)狀分析，大多數(shù)的臨床研究均對糖尿病與白質(zhì)病變之間的相關(guān)性提供了積極的支持的證據(jù)，提示糖尿病是LA的重要危險因素之一，認可糖尿病加重了LA的認知損害。但也仍有一部分臨床研究得出了不支持的結(jié)果。關(guān)于糖尿病、LA及其相關(guān)認知障礙三者之間的關(guān)系的尚待進一步開展更多，更深入的多學科協(xié)同的研究。

圖1TIM-3外顯子區(qū)域 －574A/C位點基因分型峰圖

漢族PNS組，蒙古族正常對照組，漢族正常對照組的基因外顯子區(qū)域 －574A/C位點基因型分布符合Hardy-Weinbery平衡定律（χ2=0.19～0.43，P均＞0.05），提示所選各組的人群基因型均符合生物遺傳平衡，具備相應的群體代表性。

漢族和蒙古族正常對照組TIM-3基因外顯子－574A/C位點基因型（AA、AC、CC）分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.60，P=0.741）；兩組間等位基因頻率的差異也無統(tǒng)計學意義（χ2=0.20，P=0.655）。因此，將漢族和蒙古族的正常對照組兒童合并作為正常對照組與漢族PNS患兒比較發(fā)現(xiàn)，漢族PNS患兒－574A/C位點AA、AC和CC基因型的頻率分別為9.52%、28.57%和61.90%，而40例正常對照組兒童AA、AC和CC基因型的頻率為25.00%、50.00%和25.00%，兩組間基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.13，P=0.017），漢族PNS患兒CC基因型的頻率較高；漢族PNS患兒的C等位基因頻率為76.2%，高于正常對照組（50%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.81，P=0.005），與A等位基因個體比較，C等位基因攜帶者兒童發(fā)生PNS的風險增加3.20倍（95%CI：1.39～7.37）。見表1。

表1 各組間TIM-3外顯子區(qū)域-574A/C位點基因多態(tài)性分布及等位基因頻率[n(%)]

2.4 IFN-γ檢測結(jié)果比較

21例PNS中，17例患兒血清中可測得低濃度IFN-γ，20例蒙古族正常對照組有18例血清可測得低濃度IFN-γ，20例漢族正常對照組中14例血清同樣可測得低濃度的IFN-γ，三組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.291）。漢族PNS、漢族正常對照以及蒙古族正常對照組血清IFN-γ水平組間差異無統(tǒng)計學意義（H=4.89，P＞0.05）。見表2。

表2 各組血IFN-γ檢測結(jié)果比較

3 討論

PNS的發(fā)病機制至今尚未完全明確，有大量證據(jù)表明其與免疫異常關(guān)系密切，尤其是與細胞免疫異常有關(guān)[1,2]。目前多項研究表明，T細胞免疫對兒童腎病綜合征有較為顯著的影響[2]。近期有學者研究發(fā)現(xiàn)TIM基因家族參與Th1/Th2細胞間平衡的調(diào)控，對于Th1/Th2細胞不平衡所致疾病，TIM可作為藥物治療的靶點，從而成為新的研究熱點。本研究通過檢測PNS患兒TIM-3基因多態(tài)性及血清IFN-γ水平，探討其相關(guān)發(fā)病機制，并進行蒙漢族基因多態(tài)性的對照，為完善該疾病基因水平的研究提供一定的數(shù)據(jù)。

TIM 家族分子的發(fā)現(xiàn)源于尋找哮喘易感基因的研究。2001年，Mclntire等[1]在第5號染色體5q33.2位置及小鼠11號染色體Bl.1位置確定了一個T細胞和氣道表型調(diào)節(jié)基因（T cell and airway phenotype regulator，Tapr），并在這一位置發(fā)現(xiàn)了TIM。在人類中鑒定了3個TIM基因（TIM-1、TIM-3、TIM-4）。TIM-3又稱甲肝病毒細胞受體2（hepatitis A virus cell receptor-2，HAVCR-2），主要表達在分化成熟的 Th1細胞上，通過與其配體（TIM3L）相互作用，調(diào)節(jié)Th1免疫應答。TIM-3可以作為區(qū)分Th1和Th2細胞的標志，有抑制Th1細胞免疫功能的作用，并參與自身免疫性疾病的發(fā)病。探討其與臨床疾病的關(guān)系，是TIM家族新近研究的熱點[3]。體外實驗顯示，TIM-3表達在分化成熟的 Th1 細胞上，而不表達在 Th2細胞上。相關(guān)研究對TIM-3啟動子區(qū)兩個SNP位點和過敏性哮喘之間的關(guān)系進行了研究，證實某些遺傳性過敏癥，例如哮喘，其敏感性和TIM-3基因－574A/C多態(tài)性位點聯(lián)系最為密切[4]。本研究以同樣存在T細胞免疫紊亂的PNS入手，通過對漢族PNS兒童與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙漢族正常對照組對比發(fā)現(xiàn)，兒童PNS攜帶外顯子－574C等位基因的頻率顯著增高，是攜帶等位基因A的3.20倍，提示TIM-3基因的外顯子－574C等位基因可能是導致兒童PNS的危險因素。

本研究中，漢族和蒙古族正常對照組TIM-3基因外顯子－574A/C位點基因型（AA、AC、CC）分布的差異無統(tǒng)計學意義?？赡芘c以下原因有關(guān)：①目前對于TIM-3基因外顯子區(qū)域的基因多態(tài)性研究分散在不同的基因位點，如－4259G/T、－1415C/T等位點，本研究僅對－574A/T位點做了相關(guān)研究，有可能在其他位點存在著蒙漢民族之間的差異，這仍有待進一步研究與證實；②本研究病例均選自內(nèi)蒙古自治區(qū)中西部地區(qū)，所有病例均無血緣關(guān)系，無其他異族通婚的蒙漢族兒童，均為祖籍三代居住在內(nèi)蒙古地區(qū)。但目前內(nèi)蒙古地區(qū)的蒙古族人群明顯漢化，飲食、文化、生活環(huán)境和生活習慣均趨于漢化，這些因素可能會影響到蒙古族兒童基因頻率的變化，引起蒙漢族之間的差異縮小，趨于近似，影響實驗結(jié)果；③本研究樣本量偏小，若擴大樣本量進行更為系統(tǒng)具有人群分布型的分析，有可能發(fā)現(xiàn)新的結(jié)果以及蒙漢族在該基因位點的差異性。

有實驗表明，TIM-3調(diào)節(jié)Th 1介導的免疫，而Th1分泌的主要細胞因子為 IFN-γ[9,10]，即人類T細胞TIM-3的表達可以調(diào)控IFN-γ的分泌[11]。因此在TIM-3基因多態(tài)性檢測的基礎上，我們對其下游調(diào)控的IFN-γ水平進行相應的檢測，明確在腎病綜合征的發(fā)病過程中，TIM-3/Th1/IFN-γ是否存在密切的關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果提示，PNS患兒與漢族、蒙古族正常對照組之間血清IFN-γ水平的差異無統(tǒng)計學意義。有研究者也完善過本類實驗并得到與我們實驗一致的結(jié)果[9]。但由于本次實驗過程中，選取的病例數(shù)較少，且病例收集的范圍局限，考慮可能存在其他方面的信號對IFN-γ的調(diào)控及釋放影響，建議完善多重信號通路方面的研究，或者行免疫組化實驗，進一步明確IFN-γ的濃度變化與腎病綜合征的發(fā)病關(guān)聯(lián)。

TIM-3有多重的生物學效應，TIM-3基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在機體受抗原刺激的初始階段，該階段對T細胞分化及定型為Th1或Th2有至關(guān)重要的作用[12,13]?？乖碳さ某潭韧瑯記Q定產(chǎn)生相應細胞因子的數(shù)量及強度。研究證實，兒童PNS時，Th2細胞數(shù)目明顯增多，但Th1類細胞數(shù)目減少，出現(xiàn)Th1細胞向Th2細胞發(fā)生遷移的趨勢，并引起相應調(diào)控的細胞因子分泌量改變，間接引起腎小球基底膜的損傷[14]。由此推測，增強或抑制TIM-3與其特異性配體的結(jié)合，避免或減輕其對Th1類細胞活化的限制，對Th1/Th2失衡相關(guān)的疾病可起到改變其導向的作用。在細胞分子水平的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在PNS患兒體內(nèi)表達降低，提示Th1細胞的失活可能導致了下游細胞因子水平的減少，從而在一定程度上引起IgE水平的變化，導致腎小球基底膜免疫沉著，損害其分子屏障，促使PNS的發(fā)生[15]。目前所有對TIM分子的研究都表明其涉及Th1/Th2細胞間的平衡，因此可作為相應平衡失調(diào)疾病的新型治療手段應用到臨床[16]。腎臟疾病有關(guān)TIM-3基因的研究才剛剛開始，其分子調(diào)節(jié)功能的許多機制仍然需要大量研究。TIM-3可能成為Th細胞上免疫調(diào)節(jié)治療的靶向分子。

本研究通過蒙漢族對照，聯(lián)合PNS病例組對比，進一步探討PNS的發(fā)病機制，為診斷治療提供新的思路。通過研究發(fā)現(xiàn)，TIM-3基因外顯子－574A/C基因位點可能參與PNS的發(fā)病過程，且該基因位點的－574 C等位基因與PNS的發(fā)病關(guān)系更為緊密，并為漢族兒童PNS的易感基因之一。IFN-γ的釋放與兒童PNS的發(fā)病及病情進展無明顯相關(guān)性。

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Signi fi cance ofTIM-3gene and IFN-γ detection in primary nephrotic syndrome in children of Han and Mongolia nationalities

HUANG Jinyue1, GUO Yanyan2, ZHAO Yun2(1. Department of Pediatrics, Tianjin Children’s Hospital, Tianjin Second Children’s Hospital, Tianjin 300134, China; 2. Department of Pediatrics, Af fi liated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia, China）

ObjectiveTo explore the association of T cell immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecule-3(TIM-3) gene polymorphism and IFN-γ levels with the incidence of primary nephrotic syndrome (PNS) in children.MethodsA case-control study was conducted and 21 Han patients with PNS were selected and included in case group. Meanwhile, 20 each from Mongolian and Han were selected and assigned into control group and at least three generations of their family members were from the same nationality. PCR-restriction fragment polymorphism analysis was used to detect and analyze single nucleotide polymorphisms of exon －574A/C inTIM-3gene in PNS children and controls. Also the genotype and allele frequencies between the two groups were compared. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the level of serum IFN-γ and its changes was analyzed.ResultsThere was no signifcant difference in the distribution of genotypes (AA,AC, CC) of exon －574A/C inTIM-3gene between the Han and Mongolian subgroups in control group (P=0.741). Neither did the allele frequency between the two groups (P=0.655). Compared with control group (Han and Mongolian), the frequencies of AA, AC and CC genotypes were 9.52%, 28.57% and 61.90% respectively in －574A/C loci of the Han nationality children with PNS. There was signifcant difference in genotypes distribution between the two groups (P=0.017). The frequency of C allele in PNS children of Han nationality was 76.2% which was higher than that in normal control group (50%), and the difference was statistically signifcant (P=0.005). Compared with A allele carriers, the risk of PNS in C allele carriers increased by 3.20times (95%CI: 1.39～7.37). There were no signifcant differences in serum IFN-γ among the Han nationality with PNS, Han and Mongolian normal control groups (P＞0.05).ConclusionThe single nucleotide polymorphism of the exon －574A/C ofTIM-3gene may be related to the pathogenesis of PNS in children. In addition, IFN-γ is not associated with the incidence of primary nephrotic syndrome in children.

primary nephrotic syndrome; gene polymorphism; child

2016-06-03）

（本文編輯：梁 華）

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.07.007

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