HPLC法測定苦參堿類生物堿傳遞體包封率

徐馨，閆志金，劉洪斌，張學(xué)棟，牛靜華，王洪斌*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161005)

HPLC法測定苦參堿類生物堿傳遞體包封率

徐馨1，2，閆志金1，劉洪斌1，張學(xué)棟1，牛靜華1，王洪斌1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161005)

高速離心分離游離的苦參堿(MAT)和氧化苦參堿(OMT)，應(yīng)用HPLC法測定MAT和OMT的濃度并計(jì)算包封率，建立苦參堿類生物堿傳遞體包封率的HPLC測定方法。結(jié)果顯示，MAT進(jìn)樣量在0.074～0.370 μg/mL、OMT進(jìn)樣量在0.263～1.315 μg/mL時(shí)，兩者峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系。在高加樣量0.148 μg/mL和低加樣量0.111 μg/mL下，MAT的平均加樣回收率分別為100.2%和98.2%，RSD分別為1.07%和2.38%;OMT的平均加樣回收率分別為98.3%和100.2%，RSD分別為0.75%和0.66%。制劑中MAT和OMT的包封率分別為80.43%和74.70%，RSD分別為1.03%和1.11%。建立的方法適用于苦參堿類生物堿傳遞體包封率的測定。

HPLC;苦參堿類生物堿;傳遞體;包封率;苦參堿;氧化苦參堿

苦參堿類生物堿是廣泛存在于豆科植物苦參、苦豆子和廣豆根中的一類喹諾里西啶類生物堿的總稱。其中藥理效果突出且含量較高的苦參堿(MAT)、氧化苦參堿(OMT)、槐果堿(SC)和氧化槐果堿(OSC)4種苦參堿類生物堿單體純品［1-3］，經(jīng)處方篩選和工藝優(yōu)化制備成傳遞體劑型［4-5］。MAT和OMT具有廣譜抗菌、抗炎、抗病毒作用［6-8］，輔以消炎鎮(zhèn)痛作用的SC可抑制急性滲出性炎癥，緩解疼痛［9-11］。OSC具有殺滅真菌、提高白細(xì)胞含量、提高機(jī)體免疫力的作用［12］。4種苦參堿類生物堿單體聯(lián)合應(yīng)用，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗真菌、抑制急性滲出性炎癥，緩解疼痛，提高白細(xì)胞含量，提高機(jī)體免疫力的功能。

傳遞體將藥物包裹于其雙分子層結(jié)構(gòu)中［13-14］，能夠克服奶牛皮膚角質(zhì)層的屏障作用［15］，將藥物輸送進(jìn)真皮層，形成藥物貯庫，再進(jìn)入血液、細(xì)胞內(nèi)，并富集于乳腺網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，發(fā)揮局部靶向給藥的作用。由于其膜具有優(yōu)越的柔順性和變形性，較小的粒徑，易于通過皮膚上的微孔道而攜帶藥物穿過皮膚。其對藥物的包封率高于普通脂質(zhì)體，穩(wěn)定性也遠(yuǎn)優(yōu)于普通脂質(zhì)體與非離子型囊泡［16］。傳遞體已被證明可提高藥物在靶位的累積濃度［17］，提高藥物的治療指數(shù)［18］，大幅改善奶牛生存質(zhì)量，提升食品安全系數(shù)。傳遞體制劑包封率對藥效起決定作用，因此，測定苦參堿類生物堿傳遞體包封率具有重要意義。為此，建立測定苦參堿類生物堿傳遞體包封率的HPLC方法，旨在為苦參堿類生物堿傳遞體制劑的質(zhì)量評價(jià)與工藝優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

MAT、OMT、SC、OSC(純度≥95%)均由黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所制備，苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(110805－200508)、氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(110780－200506)均購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈、無水乙醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取經(jīng)P2O5減壓干燥至恒質(zhì)量的MAT和OMT標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別以乙腈－無水乙醇(體積比80∶20)溶解，制成含MAT 0.074 mg/mL、OMT 0.263 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻完全溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 苦參堿類生物堿傳遞體包封率的測定方法

苦參堿類生物堿傳遞體由黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所自制，高速離心分離游離藥物。精密移取適量苦參堿類生物堿傳遞體混懸液置于Amicon Ultra離心超濾管的截留管中，以6 000 r/min的速度離心20 min，取超濾液。測定MAT和OMT濃度(C1)，并計(jì)算游離藥物量(W1)。另取適量苦參堿類生物堿傳遞體混懸液置于容量瓶中破乳，并以流動(dòng)相乙腈－無水乙醇－3%磷酸溶液(體積比80∶10∶10)稀釋至刻度后，轉(zhuǎn)移至Amicon Ultra離心超濾管的截留管中，以5 000 r/min的速度離心5 min，取外管中的超濾液，測定MAT和OMT濃度(C2)，并計(jì)算出傳遞體中的藥物總量(W2)。按照以下公式計(jì)算包封率和載藥量［19］。包封率(E)=(W2－W1)/ W2×100%。

1.4 測定苦參堿類生物堿傳遞體中MAT和OMT含量的HPLC方法的建立

1.4.1 色譜條件色譜柱選擇氨基柱Amino (5 μm，4.6 mm×250 mm)，以乙腈－無水乙醇－3%磷酸溶液(體積比80∶10∶10)為流動(dòng)相［20-21］，檢測波長選擇220 nm，體積流量選擇1.0 mL/min，柱溫選擇25℃，每次進(jìn)樣10 μL。

1.4.2 線性關(guān)系試驗(yàn)分別精密吸取1.2中制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1、2、3、4、5 mL，分別置于5個(gè)10 mL容量瓶中，加入乙腈－無水乙醇(體積比80∶20)稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按1.4.1中色譜條件進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算以得到MAT和OMT的回歸方程。

1.4.3 精密度試驗(yàn)分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按1.4.1中色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，測定峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批樣品超濾液稀釋100倍，分別于0、1、2、4、6 h進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算RSD。

1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品溶液6份，測定MAT和OMT的RSD。

1.4.6 加樣回收率試驗(yàn)精密吸取1.3中制備的含MAT和OMT的超濾液0.6 mL，置于100 mL容量瓶中，共6份，前3份分別加入1.2中制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，后3份分別加入15 μL，分別加入無水乙醇溶液定容，充分搖勻使其溶解，分別測定在高加樣量0.148 μg/mL和低加樣量0.111 μg/mL下MAT的含量，同法測得在高加樣量0.526 μg/mL和低加樣量0.395 μg/mL下OMT的含量，分別計(jì)算平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參堿類生物堿傳遞體中MAT和OMT含量HPLC測定方法的檢驗(yàn)

2.1.1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得到MAT和OMT的回歸方程分別為:A= 4.215C－1.076(r=0.999 7)和A=4.736C－0.830 (r=0.999 6)。結(jié)果表明，MAT進(jìn)樣量在0.074～0.370 μg/mL、OMT進(jìn)樣量在0.263～1.315 μg/mL時(shí)峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6次測得的MAT和OMT質(zhì)量濃度的RSD分別為RSDMAT=1.3%和RSDOMT= 0.8%。表明儀器精密度良好，方法重現(xiàn)性滿足分析要求。

表1 精密度考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果見表2。同一批樣品分別在0、1、2、4、6 h進(jìn)樣測得的MAT和OMT質(zhì)量濃度的RSD分別為RSDMAT= 1.4%，RSDOMT=1.0%。結(jié)果表明，供試藥品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性考察試驗(yàn)結(jié)果見表3。同一批樣品溶液測定6次，所得的MAT和 OMT質(zhì)量濃度的RSD分別為1.5%和1.1%。以上結(jié)果表明，供試藥品重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果MAT和OMT的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。求得高、低加樣量下MAT的平均回收率分別為100.2%和98.2%， RSD分別為1.07%和2.38%;OMT的平均回收率分別為98.3%和100.2%，RSD分別為0.75%和0.66%。結(jié)果表明，建立的檢測方法準(zhǔn)確。

表4 MAT加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 OMT加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 HPLC法測定的MAT和OMT的包封率

藥物包封率是傳遞體給藥體系安全、有效與實(shí)現(xiàn)靶向治療的重要基礎(chǔ)，故包封率是傳遞體給藥系統(tǒng)中的重要質(zhì)量參數(shù)。本試驗(yàn)經(jīng)計(jì)算可知，MAT的包封率為80.43%，OMT的包封率為74.70%，二者RSD分別為1.03%和1.11%。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了HPLC法測定苦參堿類生物堿四元傳遞體中主成分藥物含量的方法，MAT進(jìn)樣量在0.074～0.370 μg/mL(r=0.999 7)、OMT進(jìn)樣量在0.263～1.315 μg/mL時(shí)峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好(r=0.999 6)。經(jīng)精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和加樣回收率試驗(yàn)顯示，該方法精密度、重現(xiàn)性、回收率均符合要求，能準(zhǔn)確快速地進(jìn)行含量測定，更能客觀地評價(jià)本制劑苦參堿類生物堿傳遞體的質(zhì)量。

包封率測定的方法很多，透析法耗時(shí)且長時(shí)間透析過程中藥物極易滲漏［22］;凝膠柱過濾和微柱過濾也存在耗時(shí)問題，且洗脫液的流速難于控制［23］;超濾法容易堵塞超濾膜，阻礙藥物被離心下來［24］。故采用操作簡捷的HPLC法測定苦參堿類生物堿四元傳遞體的包封率。

本研究建立的HPLC測定方法，適用于測定苦參堿類生物堿傳遞體MAT和OMT含量。其精密度和靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好，方法可靠，操作簡便。制備的苦參堿類生物堿傳遞體包封率高，性質(zhì)穩(wěn)定［5］。研究結(jié)果為苦參堿類生物堿傳遞體制劑的質(zhì)量評價(jià)與工藝優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

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Determination of Embedding Ratio of Alkaloids Transfersomes of Sophora flavescens Ait.by HPLC

XU Xin1，2，YAN Zhijin1，LIU Hongbin1，ZHANG Xuedong1，NIU Jinghua1，WANG Hongbin1*
(1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161005，China)

Free matrine and oxymatrine was separated from Sophora flavescens Ait.with high speed centrifugation，and were determined with HPLC for determining the embedding ratio of Sophora flavescens Ait.alkaloids transfersomes.The results showed that the calibration curves of matrine and oxymatrine were in good linearity over the rang of 0.074—0.370 μg/mL and 0.263—1.315 μg/mL，respectively.The average recoveries of matrine，which under 0.148 μg/mL and 0.111 μg/mL quantities of reference substance，was 98.2%and 100.2%respectively(RSD=1.07%and 2.38%).Besides，the average recoveries of oxymatrine was 98.3%and 100.2%respectively(RSD=0.75%and 0.66%).The embedding ratio of matrine and oxymatrine，which comprised in Sophora flavescens Ait.alkaloids transfersomes，were 80.43%and 74.70%respectively(RSD=1.03%and 1.11%).The method could be used for determining the embedding ratio of Sophora flavescens Ait.alkaloids transfersomes.

HPLC;Sophora flavescens Ait.alkaloids;transfersomes;embedding ratio;matrine(MAT); oxymatrine(OMT)

S859.1

A

1004－3268(2017)07－0125－04

2016－12－26

齊齊哈爾市科技攻關(guān)項(xiàng)目(ssykt2014－4)

徐馨(1983－)，女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，碩士，主要從事新藥研發(fā)工作。E－mail:25xx99@163.com

*通訊作者:王洪斌(1958－)，男，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，主要從事數(shù)字化畜牧業(yè)、動(dòng)物新藥開發(fā)等方面的研究。E－mail:uni9601@163.com