山羊FSHR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能分析

楊佳棟，劉月琴，張英杰

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000)

山羊FSHR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能分析

楊佳棟，劉月琴，張英杰

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000)

通過ProtParam和ProtScale等在線軟件對山羊FSHR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位及功能進(jìn)行分析，分別使用Chou－Fasman和同源建模方法對二級、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并對采用鄰近法構(gòu)建的不同物種FSHR基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，山羊FSHR基因編碼蛋白由695個氨基酸殘基組成，包含7個跨膜域和1個G蛋白耦合受體，屬于不穩(wěn)定蛋白，具有較高的親水性;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因編碼蛋白分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和線粒體內(nèi);二級結(jié)構(gòu)主要是α螺旋，三級結(jié)構(gòu)富含helix螺旋結(jié)構(gòu)域和長鏈卷曲。對不同物種FSHR基因編碼蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，與其他物種相比，山羊與綿羊、家牛、野豬親緣關(guān)系較近，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與其動物學(xué)分類結(jié)果一致。

FSHR基因;系統(tǒng)發(fā)育分析;功能預(yù)測;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

繁殖性狀是評價山羊產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要經(jīng)濟(jì)性狀［1］。激素作為動物機(jī)體分泌的特殊化學(xué)物質(zhì)，對其生長發(fā)育、代謝及繁殖等生理活動有重要的調(diào)節(jié)作用［2］。促卵泡素受體(FSHR)由FSHR基因編碼，可通過不同的激素刺激而進(jìn)行表達(dá)［3］。FSHR蛋白作為G蛋白耦合受體超家族成員之一［4］，其表達(dá)情況決定了卵巢獲得促性腺激素(gonadotropic hormone，GTH)反應(yīng)的能力，F(xiàn)SHR的缺失使卵泡無法正常發(fā)育，嚴(yán)重的可導(dǎo)致繁殖力降低甚至不孕［2］。開展山羊FSHR基因研究對提高山羊繁殖性狀研究具有重要意義。已有研究表明，F(xiàn)SHR基因表達(dá)量對繁殖率有重要影響。在對多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢的免疫組化研究過程中發(fā)現(xiàn)，兩者的FSHR基因表達(dá)量存在差異，但均與繁殖率相關(guān)［5］。與低繁殖力的貴州山羊卵巢組織中的FSHR基因表達(dá)量相比，高繁殖力的黔北麻羊、貴州白山羊在同一組織中FSHR基因的表達(dá)總量較高［6］。高繁殖力的沂蒙黑山羊卵巢組織中FSHR基因的表達(dá)量顯著高于低繁殖力的山羊［7］。在超數(shù)排卵效果不同的綿羊卵巢中，發(fā)現(xiàn)排卵效果與其卵巢上FSHR分布有相關(guān)性［8］。人卵泡中的FSHR基因表達(dá)不足會引起原發(fā)性不育癥［9-10］?？梢?，山羊FSHR基因是影響山羊繁殖性狀的重要基因，對FSHR基因進(jìn)行研究對調(diào)控母羊排卵等有重要意義。將生物信息技術(shù)和分子育種等知識運用到傳統(tǒng)的育種領(lǐng)域，對遺傳資源的利用、保護(hù)及育種目標(biāo)的實現(xiàn)有重要價值。為此，利用生物信息學(xué)方法對山羊FSHR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、各級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和功能等進(jìn)行預(yù)測，采用鄰近法分析不同物種FSHR基因編碼蛋白在進(jìn)化中的親緣關(guān)系，以進(jìn)一步豐富山羊FSHR基因的遺傳信息，以期為FSHR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中分析的各物種FSHR基因編碼蛋白序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取，包括東非狒狒(XP_ 003908694.2)、褐家鼠(NP_954707.1)、黑猩猩(XP_ 525753.2)、家馬(NP_001157485.1)、家貓(NP_ 001041479.1)、家牛(NP_776486.1)、家犬(XP_ 013972995.1)、綿羊(NP_001009289.1)、人(NP_ 000136.2)、山羊(NP_001272565.1)、小家鼠(NP_ 038551.3)、雪貂(XP_004752903.1)、野豬(NP_ 999551.2)、原雞(NP_990410.1)。

1.2 方法

應(yīng)用多種生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件對山羊FSHR基因編碼蛋白序列進(jìn)行預(yù)測和分析;利用Bioedit軟件的ClustalW分別對不同物種FSHR基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，并保存為fasta格式文件;再采用MEGA 6.0中的鄰近法，選擇Pairwise Distance(自舉檢驗法Bootstrap=1 000)對其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測網(wǎng)址:http:// web.expasy.org/protparam/;疏水性分析網(wǎng)址:http://web.expasy.org/protscale/;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)址:http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/;跨膜結(jié)構(gòu)域分析網(wǎng)址:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/;信號肽分析網(wǎng)址:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/;亞細(xì)胞定位分析網(wǎng)址:http://www.genscript.com/psort.html;三級結(jié)構(gòu)模型的建立網(wǎng)址:https://swissmodel.expasy.org/;蛋白質(zhì)功能基序預(yù)測網(wǎng)址:http://prosite.expasy.org/;蛋白質(zhì)功能分類的預(yù)測網(wǎng)址:http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSHR基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

山羊FSHR基因cDNA全長共2 085 bp，編碼695個氨基酸，位于11號染色體，包含10個外顯子和9個內(nèi)含子。由圖1可知，F(xiàn)SHR基因編碼蛋白中相對含量較高的氨基酸是Leu(12.5%)和Ser (8.3%)，等電點為6.4，總的帶負(fù)電荷殘基(Asp+ Glu)為63個，總的帶正電荷殘基(Arg+Lys)為57個。推測其編碼蛋白的分子式為C3545H5547N915O996S40，原子總數(shù)為11 043個。

由表1可知，F(xiàn)SHR蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.86，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)和親水性總平均值分別為105.80和0.234。第385個氨基酸疏水性值(3.622)最高，第428個氨基酸親水性值(－2.378)最高(圖2)，具有較高的親水性。

圖1 山羊FSHR基因編碼蛋白的各氨基酸成分

表1 不同物種FSHR基因編碼蛋白的理化參數(shù)

圖2 山羊FSHR基因編碼蛋白親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果

2.2 FSHR基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

Chou－Fasman在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示，山羊FSHR基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是α螺旋，所占比例為71.9%，其次是β折疊和β轉(zhuǎn)角，比例分別是51.8%和9.5%，α螺旋主要分布于編碼的多肽鏈主鏈骨架前、中段，在后端分布也較為均勻。SignalP預(yù)測結(jié)果表明，第18個氨基酸的最高原始剪切位點得分是0.749，同時該位點被結(jié)合的剪切位點最高得分是0.847，第19個氨基酸信號肽的最高得分是0.981，第1～17個氨基酸的信號肽平均得分為0.956，趨向于+1，表明山羊FSHR基因編碼蛋白存在信號肽。如圖3所示，山羊FSHR基因編碼蛋白共有7個跨膜區(qū)，分別位于第367—389、402—424、444—466、490—512、532—554、575—597、 607—695個氨基酸，第1—366、425—443、513—531、598—606個氨基酸位于胞外，第390—401、467—489、555—574個氨基酸位于胞內(nèi)，表明山羊FSHR基因編碼蛋白為跨膜蛋白。

圖3 山羊FSHR基因編碼蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

2.3 FSHR基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，山羊FSHR基因編碼蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(44.4%)，在液泡(22.2%)、線粒體(11.1%)、細(xì)胞質(zhì)(11.1%)及高爾基體(11.1%)中也有少量分布。FSHR基因編碼蛋白大部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，主要發(fā)揮受體、運輸和結(jié)合的作用。

2.4 FSHR基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)分析及其功能位點預(yù)測

基于同源建模的方法對山羊FSHR基因編碼蛋白建立空間結(jié)構(gòu)，同源建模的模板為4ay9.2.C。如圖4所示，F(xiàn)SHR基因編碼蛋白含有豐富的helix螺旋結(jié)構(gòu)富集域和長鏈卷曲。如圖5所示，第379—626個氨基酸為GS結(jié)構(gòu)域(29.780)，為G蛋白耦合受體(G protein coupled receptor)，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ蒄SHR受體介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶－環(huán)磷酸腺苷(cAMP)途徑有重要作用。

圖4 山羊FSHR基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖5 山羊FSHR基因編碼蛋白功能位點預(yù)測結(jié)果

2.5 FSHR基因編碼蛋白功能分類的分析

如表2所示，對山羊FSHR基因編碼蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白作為嘌呤和嘧啶在山羊體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，并具有運輸和結(jié)合的功能，這與其主要作為受體和運輸載體緊密相關(guān)。上述結(jié)果提示，山羊FSHR基因編碼蛋白的跨膜域與其結(jié)合和運輸?shù)茸饔玫陌l(fā)揮有重要的相關(guān)性。

表2 FSHR基因編碼蛋白功能分類的預(yù)測結(jié)果

2.6 不同物種FSHR基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖6所示，對14個不同物種FSHR基因編碼蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明，偶蹄目的綿羊、山羊、家牛和野豬聚為一類;食肉目的家貓、家犬和雪貂聚為一類;奇蹄目的家馬再與偶蹄目和食肉目相聚類;靈長目的東非狒狒、黑猩猩和人聚為一類;嚙齒目的褐家鼠和小家鼠聚為一類。在各聚類中，偶蹄目和食肉目間的親緣關(guān)系較近，兩者聚類后再與靈長目和嚙齒目聚類，哺乳綱物種與唯一的原雞(鳥綱)之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 不同物種FSHR基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

促卵泡素(FSH)對雌性和雄性動物的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用均由其受體FSHR來介導(dǎo)。因此，F(xiàn)SHR受體在靶細(xì)胞中的含量及其敏感度對FSH生理功能的實現(xiàn)有重要作用。有研究表明，F(xiàn)SHR含量的高低可能與家畜的繁殖力相關(guān)。高產(chǎn)冀中山羊卵巢中FSHR基因mRNA表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)冀中山羊［11］。多態(tài)羅曼諾夫綿羊卵泡中FSHR基因mRNA表達(dá)量高于法蘭西島綿羊［12］。蛋白質(zhì)能將生命中的多種形式緊密聯(lián)系起來，且參與機(jī)體內(nèi)每個細(xì)胞的組成［13］。生物信息學(xué)的預(yù)測和分析，可以使人們從分子的角度更好地了解基因序列所內(nèi)涵的結(jié)構(gòu)和功能信息［14］。本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)對山羊FSHR基因編碼蛋白一級、二級及三級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、功能基序及功能分類進(jìn)行預(yù)測和分析，有利于進(jìn)一步認(rèn)識和分析山羊FSHR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能。

本研究通過分析不同物種FSHR基因編碼蛋白序列發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因編碼蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。該結(jié)果與Sprengel等［15］研究結(jié)果一致。人和大多數(shù)哺乳動物FSHR基因編碼區(qū)包含10個外顯子和9個內(nèi)含子，第10個外顯子編碼跨膜域及胞內(nèi)域［16-17］。山羊FSHR基因編碼695個氨基酸，其中第1—17個氨基酸編碼蛋白為信號肽，第367—389、402—424、444—466、490—512、532—554、575—597、607—695個氨基酸為跨膜域。有研究表明，F(xiàn)SHR基因的第2～4個跨膜域部分具有高度的保守性，但其他跨膜域保守性較低。其中第4、第6、第7個跨膜域部分存在同源性，高度保守的Asn－Arg－Tyr三聯(lián)體基序可能在受體及G蛋白中起核心作用［18］。通過Chou－Fasman在線軟件預(yù)測［19］，α螺旋在山羊FSHR基因編碼的整個多肽鏈主鏈骨架上所占比例較大，α螺旋與水分子的親和性較高，能在脅迫狀態(tài)下阻止內(nèi)部組織水分子損失［20］，推測與其蛋白質(zhì)的親水性相關(guān)。分子功能的正常發(fā)揮依賴于其結(jié)構(gòu)的保守性和穩(wěn)定性［21-22］。山羊FSHR基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)富含helix螺旋結(jié)構(gòu)域和長鏈卷曲。該基因編碼蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，發(fā)揮運輸和結(jié)合等作用，并在靶細(xì)胞中主要扮演受體和運載體的角色。Vannier等［23］在表達(dá)FSHR細(xì)胞中，通過抗FSHR的單克隆抗體的Western雜交檢查到2種不同大小的蛋白質(zhì)，分別是含有寡糖鏈的成熟FSHR分子(分子質(zhì)量87 ku)和富含甘露糖的FSHR前體分子(分子質(zhì)量81 ku)。山羊FSHR基因編碼的第379—626個氨基酸為GS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是G蛋白耦合受體。該結(jié)構(gòu)域?qū)τ蒄SHR受體介導(dǎo)的cAMP途徑有重要作用。Van Loenen等［24］在對支持細(xì)胞cAMP的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH與FSHR的結(jié)合需要幾個小時，但穩(wěn)定態(tài)的激活僅需幾分鐘。因此，F(xiàn)SHR功能與FSH的結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有密切聯(lián)系。

本研究對14個不同物種FSHR基因編碼蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，東非狒狒、黑猩猩和人(靈長目)親緣關(guān)系較近，山羊、綿羊、家牛和野豬(偶蹄目)親緣關(guān)系較近，家貓、家犬和雪貂(食肉目)親緣關(guān)系較近，褐家鼠和小家鼠(嚙齒目)親緣關(guān)系較近，而原雞(鳥綱)與上述哺乳動物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，該結(jié)果與動物學(xué)分類結(jié)果一致。提示FSHR基因在遺傳進(jìn)化過程中具有高度保守性。

［1］陳祥，龍威海，孫振梅，等.貴州地方山羊FSHR基因與繁殖性狀的相關(guān)性研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2017，25(1):94-101.

［2］黃賀.北極狐ESR和FSHR基因多態(tài)性、表達(dá)及其與產(chǎn)仔關(guān)系的研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2013.

［3］王文芳，何玉琴，韓志磊，等.高原甘加型藏羊發(fā)情周期不同階段卵巢FSHR和LHR基因表達(dá)差異的研究［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46(1):97-103.

［4］蔡婕，黃荷鳳，金帆.卵泡刺激素受體基因突變的研究［J］.國外醫(yī)學(xué)(計劃生育分冊)，2005，24(2):69-72.

［5］王惠娥，汪瀾，王艷萍，等.多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢促卵泡素受體的定位研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，51(5):957-962.

［6］龍威海，丁玫，馮文武，等.卵泡刺激激素受體基因(FSHR)在貴州地方山羊的多態(tài)性及表達(dá)研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2015，23(6):755-761.

［7］石中強，徐艷，王樹迎，等.沂蒙黑山羊子宮中FSHR和LHR基因在發(fā)情周期內(nèi)的表達(dá)規(guī)律［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，43(1):48-54.

［8］倪和民，張鴻波，劉云海，等.超數(shù)排卵效果不同綿羊卵巢卵泡促卵泡素受體的分布［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，44(6):1232-1238.

［9］Borgbo T，Jeppesen J V，Lindgren I，et al.Effect of the FSH receptor singlenucleotidepolymorphisms(FSHR 307/680)on the follicular fluid hormone profile and the granulosa cell gene expression in human small antral follicles［J］.Mol Hum Reprod，2015，21(3):255-261.

［10］周立花，李汶，盧光琇.FSHR、LHR基因突變與多態(tài)對女性生殖的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10 (1):186-189.

［11］唐杰.山羊促性腺激素及其受體mRNA豐度的研究［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［12］Abdennebi L，Monget P，Pisselet C，et al.Comparative expression of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone receptors in ovarian follicles from high and low prolific sheep breeds［J］.Biol Reprod，1999，60(4): 845-854.

［13］何建川，邵陽，張波.蛋白質(zhì)和變性蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的FTIR分析進(jìn)展［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2012，24 (8):1176-1180.

［14］李麗莎，李祥龍，毛艷朋，等.山羊TYRP1基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學(xué)分析［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(10):147-152.

［15］Sprengel R，Braun T，Nikolics K，et al.The testicular receptor for follicle stimulating hormone:Structure and functional expression of cloned cDNA［J］.Mol Endocrinol，1990，4(4):525-530.

［16］Marsters P，Kendall N R，Campbell B K.Temporal relationships between FSH receptor，type 1 insulin-like growth factor receptor，and aromatase expression during FSH-induced differentiation of bovine granulosa cells maintained in serum-free culture［J］.Mol Cell Endocrinol，2003，203 (1/2):117-127.

［17］Daelemans C，Smits G，de Maertelaer V，et al.Prediction of severity of symptoms in iatrogenic ovarian hyperstimulation syndrome by follicle-stimulating hormone receptor Ser680Asn polymorphism［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89(12):6310-6315.

［18］Gudermann T，Nürnberg B，Schultz G.Receptors and G proteins as primary components of transmembrane signal transduction.Part 1.G-protein-coupled receptors:Structure and function［J］.J Mol Med(Berl)，1995，73(2): 51-63.

［19］Chou P Y，F(xiàn)asman G D.Empirical predictions of protein conformation［J］.Annual Review of Biochemistry，1978，47:251-276.

［20］Maskin L，Gudesblat G E，Moreno J E，et al.Differential expression of the members of the Asr gene family in tomato(Lycopersicon esculentum)［J］.Plant Science，2001，161(4):739-746.

［21］張菊，杜立新，李宏濱，等.綿羊MC4R基因的半定量RT－PCR及生物信息學(xué)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41(7):804-810.

［22］連云涓.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的多核學(xué)習(xí)方法［D］.上海:上海交通大學(xué)，2013.

［23］Vannier B，Loosfelt H，Meduri G，et al.Anti-human FSH receptor monoclonal antibodies:Immunochemical and immunocytochemical characterization of the receptor［J］.Biochemistry，1996，35(5):1358-1366.

［24］Van Loenen H J，F(xiàn)linterman J F，Rommerts F F G.Follicle-stimulating hormone stimulates rat sertoil cells via relatively low affinity binding sites［J］.Endocrine，1994，2(11):1023-1029.

Structure and Function Analysis of Goat FSHR Gene-Coding Protein

YANG Jiadong，LIU Yueqin，ZHANG Yingjie
(College of Animal Science and Technology，Agriculture University of Hebei，Baoding 071000，China)

In this study，the physical and chemical properties，subcellular localization and function of goat FSHR gene were analyzed by ProtParam and ProtScale online software.Chou-Fasman and homology modeling methods were used to predict the secondary structure and tertiary structure，respectively.Phylogenetic trees of different species of FSHR genes were constructed by the neighbor joining method.Goat FSHR gene encoding protein was an unstable protein containing seven transmembrane domains and one G protein coupled receptors，and it had high hydrophilicity.The subcellular localization of FSHR gene was in endoplasmic reticulum，vacuole and mitochondria.Secondary structure was mainly alpha helix，and tertiary structure was rich in helix domain and long chain coil.Compared with other species，goats had closer genetic relationship with sheep，cattle and pig.Different mammalian FSHR genes were highly conserved in evolution，and phylogenetic results were consistent with their animal taxonomy.

FSHR gene;phylogenetic analysis;function prediction;protein structure

S855.3

A

1004－3268(2017)07－0120－05

2017－02－10

國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS－39)

楊佳棟(1977－)，男，河北保定人，講師，碩士，主要從事反芻動物營養(yǎng)研究。E－mail:hbnydx96@126.com