水稻干尖線蟲的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測方法

白宗師 秦萌 趙立榮 韓玉春 王東偉 徐春玲 謝輝, *

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水稻干尖線蟲的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測方法

白宗師1秦萌2趙立榮3韓玉春4王東偉1徐春玲1謝輝1, *

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物線蟲研究室/植物檢疫線蟲檢測與防疫研究中心，廣州 510642；2全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，北京100125；3廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心植物檢疫實(shí)驗(yàn)室，廣州510623；4海南出入境檢驗(yàn)檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心，?？?570311；*通訊聯(lián)系人，E-mail：xiehui@scau.edu.cn)

【目的】本研究旨在為水稻干尖線蟲(Christie, 1942)的快速檢測鑒定和早期診斷提供一個(gè)新的檢測方法。【方法】利用水稻干尖線蟲18S核糖體RNA基因，設(shè)計(jì)了水稻干尖線蟲LAMP的特異引物，該引物包括1對外引物、1對內(nèi)引物和1對環(huán)引物，以LAMP特異引物對待測樣品DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳法和熒光染料法進(jìn)行檢測，電泳檢測出現(xiàn)階梯狀條帶或加入熒光染料顯現(xiàn)綠色熒光，則證明待檢樣品中含有水稻干尖線蟲?！窘Y(jié)果】本方法可以檢測鑒定水稻干尖線蟲不同蟲態(tài)（雌蟲、雄蟲、幼蟲或卵）的個(gè)體，可以從多種線蟲混合的樣品和植物組織樣品中直接檢測出水稻干尖線蟲，檢測靈敏度達(dá)到1/1000條蟲DNA?！窘Y(jié)論】本檢測方法具有準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定和結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)，且操作簡便、實(shí)用性強(qiáng)。

水稻干尖線蟲；LAMP；快速檢測；靈敏度

水稻干尖線蟲(Christie, 1942)是一種寄生在植物地上部，并引起危害的一種葉線蟲，最初在草莓上發(fā)現(xiàn)，之后發(fā)現(xiàn)該線蟲導(dǎo)致水稻發(fā)生干尖病。水稻干尖線蟲能寄生200多種植物，每年為害水稻造成約16億美元的嚴(yán)重?fù)p失[1]。水稻干尖線蟲是種傳作物病原線蟲，廣泛分布于世界大多數(shù)水稻種植區(qū)[2-3]，造成水稻田間產(chǎn)量損失10%~30%，為害嚴(yán)重的減產(chǎn)高達(dá)50%以上[4-5]。在20世紀(jì)40年代，水稻干尖線蟲由日本傳入中國。在20世紀(jì)50－60年代，我國水稻干尖線蟲病發(fā)生嚴(yán)重，被列為檢疫線蟲[6]，后因采取嚴(yán)格檢疫和種子處理措施，該病害在20世紀(jì)80年代基本受到控制。但是近10多年，該病害的發(fā)生范圍和為害嚴(yán)重度又開始加大，目前在我國主要稻區(qū)均有分布，局部地區(qū)發(fā)生和為害嚴(yán)重[2, 7-10]。

水稻干尖線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定主要根據(jù)雌蟲的體長、側(cè)線數(shù)、后陰子宮囊長、尾部形態(tài)和雄蟲的交合刺長[11]。這些特征需要用高倍顯微鏡才可以觀察到，并且卵和幼蟲均不適用于用形態(tài)學(xué)方法鑒定。此外，水稻干尖線蟲所隸屬的滑刃屬()有100多個(gè)種，蟲體都非常細(xì)小，長度通常只有0.2～1.3 mm，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定大量相似的滑刃屬線蟲的種類非常困難[12]。因此，研究和使用分子生物學(xué)方法快速準(zhǔn)確地檢測鑒定水稻干尖線蟲是非常有必要的。目前已有根據(jù)水稻干尖線蟲的rDNA-ITS序列，設(shè)計(jì)水稻干尖線蟲的特異性引物，利用PCR技術(shù)對水稻干尖線蟲進(jìn)行分子鑒定的方法[13]，該方法具有準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在著一定的限制。比如需要用精密的PCR儀，檢測過程復(fù)雜、時(shí)間較長，結(jié)果必須通過瓊脂糖凝膠電泳檢測才可以判定，不能滿足口岸和調(diào)運(yùn)檢疫以及田間監(jiān)測的需求。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplication, LAMP)是2000年開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[14]。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增速度快、對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低以及檢測結(jié)果易于觀察等特點(diǎn)[15]。LAMP技術(shù)的出現(xiàn)為病原微生物的檢測提供了一種方便快捷的途徑[16-21]。目前已報(bào)道將LAMP應(yīng)用于檢測松材線蟲()[22-23]、象耳豆根結(jié)線蟲()[24]、禾谷胞囊線蟲()[25]、香蕉穿孔線蟲()[26]、北方根結(jié)線蟲()[27]和蘋果根結(jié)線蟲()[28]等植物線蟲。本研究基于水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因設(shè)計(jì)了對該種線蟲進(jìn)行LAMP的特異引物，并利用所設(shè)計(jì)的LAMP引物研究建立了具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高和可操作性強(qiáng)的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試線蟲和植物材料

供試線蟲包括26個(gè)水稻干尖線蟲()種群(表1)和菊花葉枯線蟲()種群，以及滑刃屬線蟲未定種1(sp. 1)、滑刃屬線蟲未定種2(sp. 2)、松材線蟲()、水稻潛根線蟲()、南方根結(jié)線蟲()和香蕉穿孔線蟲()。其中，除了水稻潛根線蟲和滑刃屬線蟲未定種種群是直接從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田中采集土壤分離獲得以外，其他線蟲均是本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。新鮮胡蘿卜購買于市場，水稻葉片采集于田間。

1.1.2 供試試劑及配制

LAMP試劑盒、鈣黃綠素、SYRB Green Ⅰ熒光染料及其他相關(guān)試劑均購自廣州東勝生物科技有公司，軟體動(dòng)物DNA微量提取試劑盒購自Magen公司，植物組織DNA提取試劑盒(Omega)購自廣州邁發(fā)生物科技有限公司，引物的合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

本研究使用的熒光染料為鈣黃綠素，鈣黃綠素與錳離子配比參照張躍偉等[29]，終濃度為0.05mmol/L鈣黃綠素和0.6mmol/L錳離子。將鈣黃綠素溶液(1mmol/L)和MnCl2溶液(1mmol/L)以體積比1∶12的比例混合配制成熒光染料。反應(yīng)前將4 μL熒光染料加在離心管蓋的內(nèi)側(cè)，LAMP反應(yīng)結(jié)束后，搖動(dòng)離心管將蓋上的染料混入擴(kuò)增產(chǎn)物，顯現(xiàn)綠色熒光為陽性，顯現(xiàn)橙色（與反應(yīng)前顏色相同）為陰性。

1.2 方法

1.2.1 水稻干尖線蟲的培養(yǎng)

胡蘿卜愈傷組織的制備主要參照陳淳等[30]和Reise等[31]的方法制備，水稻干尖線蟲的消毒和接種參照裴艷艷等[32]和彭曉放等[33]的方法。

1.2.2 DNA的提取

單條線蟲DNA提取參照王江嶺等[34]的方法，混合蟲態(tài)線蟲的微量DNA提取參照Magen公司的軟體動(dòng)物組織DNA提取試劑盒(HiPure Mollusc DNA Mini Kit)說明書進(jìn)行操作?；煊兴靖杉饩€蟲植物組織的DNA提取參照Omega公司的植物DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit)說明書進(jìn)行。

1.2.3 水稻干尖線蟲LAMP引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增和檢測

為了得到LAMP引物，本研究在NCBI上下載水稻干尖線蟲18S核糖體RNA基因序列(GenBank登錄號：JF826519.1)，通過Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)水稻干尖線蟲18S核糖體RNA基因的PCR引物，對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和比對確定其序列。然后基于該基因序列通過LAMP引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)獲得一對LAMP引物。利用該引物，在恒溫條件下對供試樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。水稻干尖線蟲LAMP反應(yīng)體系為2.5 μL 10×Thermopol緩沖液、1 μL F3/B3(25×)、1 μL FIP/BIP(25×)、1 μL LB/LF(25×)、6 μL dNTPs (10 mmol/L)、1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)、1 μL Bst2.0 Warmstart DNA聚合酶(8 U/μL)、1 μL 模板 DNA、4 μL 甜菜堿和6 μL ddH2O(引物25倍混合液包括40 μmol/L FIP、40 μmol/L BIP、5 μmol/L F3、5 μmol/L B3、10 μmol/L LB和10 μmol/L LF)。LAMP反應(yīng)條件如下：65℃下溫育60min，80℃保溫 10min。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染料直觀目測法。瓊脂糖凝膠電泳檢測方法：使用1%瓊脂糖凝膠在5~10 V/cm 電壓下電泳25 min檢測LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)LAMP特征性階梯狀條帶，證明有水稻干尖線蟲。熒光染料直觀目測檢測方法：在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4 μL熒光染料，可觀察到綠色熒光，證明有水稻干尖線蟲。

1.2.4 水稻干尖線蟲LAMP特異性、穩(wěn)定性和靈敏性檢測

用香蕉穿孔線蟲、松材線蟲、潛根線蟲、南方根結(jié)線蟲和滑刃屬線蟲作為對照測試水稻干尖線蟲LAMP引物的特異性；用26個(gè)水稻干尖種群作為水稻干尖線蟲LAMP特異引物的穩(wěn)定性測試對象；用電泳法及熒光染料法檢測反應(yīng)結(jié)果；將單條線蟲的DNA梯度濃度稀釋液進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分別按1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105梯度進(jìn)行稀釋，檢測反應(yīng)靈敏度。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.5 混合樣品中水稻干尖線蟲的LAMP檢測

混合樣品檢測包括水稻干尖線蟲與植物組織混合樣品DNA的LAMP檢測以及水稻干尖線蟲和對照線蟲混合樣品DNA的LAMP檢測。水稻干尖線蟲與植物組織混合樣品檢測：用軟體動(dòng)物組織DNA提取試劑盒(Hipure Mollusc DNA Mini Kit)和植物DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit )方法提取水稻干尖線蟲與植物組織混合樣品DNA并進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。混合樣品處理為30條水稻干尖線蟲和20 mg水稻葉片組織混合的DNA，陰性對照處理為不包含水稻干尖線蟲的水稻葉片組織DNA，設(shè)置空白對照處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。

水稻干尖線蟲和對照線蟲混合樣品DNA的LAMP檢測包括以下處理：(1)空白對照；(2)菊花葉枯線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲的混合樣品DNA；(3)水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲和松材線蟲的混合樣品DNA；(4)水稻干尖線蟲、水稻潛根線蟲和南方根結(jié)線蟲的混合樣品DNA；(5)水稻干尖線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品DNA；(6)水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲、松材線蟲和水稻潛根線蟲的混合樣品DNA；(7)水稻干尖線蟲、南方根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品DNA；(8)水稻干尖線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結(jié)線蟲和香蕉穿孔線蟲的混合樣品DNA。每個(gè)處理中的每種線蟲均為單條線蟲，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻干尖線蟲LAMP引物設(shè)計(jì)及檢測

用水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因的PCR引物對水稻干尖線蟲DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接測序后得到1080 bp的片段，經(jīng)過序列比對后，證明其和水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因序列一致。基于該序列，通過LAMP引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)一組水稻干尖線蟲LAMP引物，該組引物包括外引物對F3(5’-CGGTATTTTGC GCGTTTTCG-3’)和B3(5’-TCGCTACGGTCCTCG AATT-3’)；內(nèi)引物對FIP(5’-TTCAGTCGTAAGAC CCGCCTTGGTCGGTGATGCGCAGGAT-3’) 和BIP(5’-CAAGGTTGCGG CCGAGTTTTATTGCGC AGCGATACGAATGC-3’)；環(huán)引物對LF(5’-T GAA ACTTGCCGAATTCACGA-3’)和LB(5’-GGTT TTG TCGGCTGAAACAATG-3’)。用設(shè)計(jì)的引物序列對供試線蟲DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測結(jié)果(圖1)顯示，水稻干尖線蟲2個(gè)種群的DNA樣品出現(xiàn)了明顯的梯狀條帶，而菊花葉枯線蟲的DNA樣品和空白對照皆未出現(xiàn)條帶。因此，確認(rèn)所設(shè)計(jì)的引物可以作為水稻干尖線蟲的LAMP引物。

M－標(biāo)記 DL2000；1－空白對照；2－水稻干尖線蟲JZ種群；3－水稻干尖線蟲HN-2種群；4和5－菊花葉枯線蟲種群。

Fig. 1. Electrophoresis detection results of amplified products ofwith LAMP specific primers.

2.2 水稻干尖線蟲LAMP引物特異性和穩(wěn)定性檢測

以水稻干尖線蟲作為測試靶標(biāo)線蟲，以香蕉穿孔線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結(jié)線蟲和滑刃屬未定種線蟲作為對照線蟲，測試水稻干尖線蟲LAMP引物的特異性。所有供試線蟲的DNA用水稻干尖線蟲LAMP引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別經(jīng)電泳法和熒光染料法檢測，結(jié)果顯示(圖2)，只有水稻干尖線蟲的DNA樣品出現(xiàn)特異條帶(圖2-A)，且加入熒光染料后顏色變?yōu)榫G色熒光(圖2-B)，6種對照線蟲DNA樣品未出現(xiàn)特異條帶，加入熒光染料后也未變色。因此，設(shè)計(jì)的水稻干尖線蟲LAMP引物具有很好的特異性。

A－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；B－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光染料反應(yīng)結(jié)果；M－標(biāo)記 DL2000；CK－空白對照；1－水稻干尖線蟲；2－松材線蟲；3－水稻潛根線蟲；4－南方根結(jié)線蟲；5－香蕉穿孔線蟲；6－滑刃屬線蟲未定種1；7－滑刃屬線蟲未定種2。

Fig. 2. Specificity detection results of amplified products ofwith LAMP primers.

A－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；B－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光染料反應(yīng)結(jié)果；M－標(biāo)記 DL2000；CK－空白對照；1~26分別為水稻干尖線蟲HM5種群、G27種群、X8種群、YQ1種群、N54種群、N71種群、N80種群、N47種群、YQ3種群、N28種群、G7種群、A-1種群、N65種群、S-2種群、X10種群、GB種群、Hq-2種群、HB種群、JZ種群、J12種群、Xi種群、HN-2種群、HC6種群、N51種群、S24種群、N10種群。

Fig. 3. Stability detection results of amplified products ofwith LAMP primers.

A和C－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；B和D－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光染料反應(yīng)結(jié)果；M－標(biāo)記 DL2000；CK－空白對照；A和B： 1－菊花葉枯線蟲；2~4－水稻干尖線蟲單條雄蟲；5~7－水稻干尖線蟲單條雌蟲；C和D： 1~3－水稻干尖線蟲單個(gè)卵；4~6－水稻干尖線蟲單條幼蟲。

Fig. 4. Detection results ofat different development stages with LAMP primers.

A－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；B－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光染料反應(yīng)結(jié)果；M－標(biāo)記 DL2000；CK－空白對照；1－水稻干尖線蟲未稀釋單條蟲DNA；2~6－10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍和10-5倍單條蟲DNA。

Fig. 5. Sensitivity detection results ofwith LAMP primers.

A－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；B－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光染料反應(yīng)結(jié)果；M－標(biāo)記 DL2000；CK－空白對照；1－不含水稻干尖線蟲的水稻葉組織；2－水稻干尖線蟲和水稻葉組織混合樣品。

Fig. 6. Detection results of mixed sample of rice leaf tissue andwith LAMP primers.

用26個(gè)水稻干尖線蟲種群進(jìn)行水稻干尖線蟲LAMP特異引物穩(wěn)定性測試。所有線蟲樣品的DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別經(jīng)電泳法和熒光染料法檢測，均出現(xiàn)了階梯狀條帶(圖3-A)和綠色熒光(圖3-B)，在種內(nèi)表現(xiàn)出了很好的穩(wěn)定性。

采用水稻干尖線蟲LAMP引物對水稻干尖線蟲單條(個(gè))雌蟲、雄蟲、幼蟲和卵的DNA樣品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別經(jīng)電泳法和熒光染料法檢測(圖4)，均分別出現(xiàn)梯狀電泳條帶(圖4-A、4-C)和綠色熒光(圖4-B、4-D)，空白和陰性對照均未出現(xiàn)特異條帶和綠色熒光。因此，設(shè)計(jì)的水稻干尖線蟲LAMP引物和反應(yīng)體系可以用來檢測這水稻干尖線蟲不同發(fā)育時(shí)期的單條線蟲或單個(gè)卵。

2.3 水稻干尖線蟲LAMP引物靈敏度檢測

將水稻干尖線蟲單條蟲的DNA濃度梯度稀釋液進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳和加入熒光染料。結(jié)果表明(圖5)，水稻干尖線蟲的單條蟲DNA模版稀釋1×103倍后仍然可以擴(kuò)增出清晰的電泳條帶(圖5-A)，加入熒光染料后則顯現(xiàn)綠 色熒光(圖5-B)。因此，建立的水稻干尖線蟲LAMP方法的檢測靈敏度為10-3條線蟲DNA。

2.4 植物組織和多種線蟲混合樣品和的水稻干尖線蟲LAMP檢測

水稻干尖線蟲與水稻葉片組織混合樣品的DNA以及水稻干尖線蟲與其他7種植物線蟲混合樣品的DNA分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳和加入熒光染料，結(jié)果表明(圖6和7)，含有水稻葉組織的樣品和多種線蟲混合樣品均出現(xiàn)明顯的特異條帶(圖6-A和7-A)，擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變?yōu)榫G色熒光(圖6-B和7-B)。因此，建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法可以直接檢測鑒定水稻葉組織樣品和多種線蟲混合樣品中的水稻干尖線蟲。

A－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；B－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光染料反應(yīng)結(jié)果；M－標(biāo)記 DL2000；CK－空白對照；1－菊花葉枯線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品；2－水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲和松材線蟲的混合樣品；3－水稻干尖線蟲、水稻潛根線蟲和南方根結(jié)線蟲的混合樣品；4－水稻干尖線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品；5－水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲、松材線蟲和水稻潛根線蟲的混合樣品；6－水稻干尖線蟲、南方根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品；7－水稻干尖線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結(jié)線蟲和香蕉穿孔線蟲的混合樣品。

Fig. 7. Detection results of mixed sample of control plant parasitic nematodes tissue andwith LAMP primers.

3 討論

線蟲的18S核糖體RNA是比較保守的一段序列，在種間具有較好的區(qū)分度。因此，本研究根據(jù)水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因設(shè)計(jì)了特異LAMP引物。用該引物對水稻干尖線蟲以及形態(tài)和生物學(xué)特性相對近似的2個(gè)目6個(gè)屬7種其他植物線蟲進(jìn)行了檢測，只有水稻干尖線蟲DNA樣品的檢測結(jié)果顯示陽性；用該引物對來自不同地區(qū)或寄主植物的26個(gè)水稻干尖線蟲群體進(jìn)行LAMP檢測，所有種群的檢測結(jié)果都出現(xiàn)了陽性。因此設(shè)計(jì)的水稻干尖線蟲LAMP引物具有非常好的特異性和穩(wěn)定性。由于本研究設(shè)計(jì)的水稻干尖線蟲LAMP引物中的1對外引物和1對內(nèi)引物對水稻干尖線蟲18S核糖體RNA序列中的6個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行識別擴(kuò)增，若6個(gè)區(qū)域中的任何區(qū)域與引物不匹配都不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，因此，相對于PCR引物只對靶序列的2個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行識別擴(kuò)增而言，水稻干尖線蟲LAMP檢測的特異性大大提高，假陽性的概率則隨之大大降低，因此檢測的準(zhǔn)確性提高。

本研究建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法分別對水稻干尖線蟲的單條雄蟲、單條雌蟲、單條幼蟲和單個(gè)卵進(jìn)行了檢測，結(jié)果均為陽性。所用檢測時(shí)間僅需1h，并且檢測靈敏度達(dá)到1/1000單條蟲DNA。而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測鑒定需要幾天時(shí)間，并且需要多條雌蟲[12]；已報(bào)道的水稻干尖線蟲PCR檢測方法則需要數(shù)小時(shí)，并且只檢測了一條線蟲DNA[13]。因此，本研究的檢測方法速度更快、靈敏度更高。本研究建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法還可以檢測混有不同種類的線蟲樣品中和植物組織樣品中的水稻干尖線蟲，省去了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和已有PCR檢測方法所要求的樣品分離步驟，從而節(jié)省了大量時(shí)間和工作量。本研究建立的LAMP結(jié)果熒光染料檢測方法，只需恒溫水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能進(jìn)行，用肉眼觀察顏色變化就可判定結(jié)果，省去了昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作過程。因此本研究的檢測效率大大提高，操作簡單、易行。

本研究建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法，實(shí)用性強(qiáng)，應(yīng)用性廣，可以廣泛應(yīng)用于口岸和調(diào)運(yùn)檢疫以及田間監(jiān)測中對水稻干尖線蟲的檢測，為水稻干尖線蟲的進(jìn)出境檢疫和調(diào)運(yùn)檢疫以及田間病害早期診斷和監(jiān)測提供了準(zhǔn)確、快速和易行的方法，對提高水稻干尖線蟲的檢出率和防控效果具有重要意義。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Diagnosis of

BAI Zongshi1, QIN Meng2,ZHAO Lirong3, HAN Yuchun4, WANG Dongwei1, XU Chunling1, XIE Hui1, *

(Laboratory of Plant Nematology and Research Center of Nematodes of Plant Quarantine,,,,;National Agro-Technical Extension and Service Centre，，；,,,;HainanEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,,;Corresponding author,:..)

【Objective】This study was performed to provide a new method for the rapid detection and early diagnosis of. 【Method】The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) specific primers ofwere designed based on the nematode18S ribosomal RNA gene, including two external primer, two inner primer and two loop primer. The DNA sample was amplified by LAMP primers using isothermal amplification. The amplified products were detected by electrophoresis and fluorescent dye. It proved that there wasin the test sample if there was clear DNA ladder in the electrophoresis results or it showed green fluorescence in the fluorescent dye results. 【Result】The results showed that LAMP primers could detect and identify single egg, juvenile, female and male of, and could also directly detectfrom multiple nematode species samples and plant tissue samples, the sensitivity of LAMP assay was 1/1000 of single nematode DNA. 【Conclusion】This diagnosis method has the advantages of accuracy, sensitivity, stability and intuitive results, and is also simple and more practical.

; LAMP; rapid diagnosis; sensitivity

10.16819/j.1001-7216.2017.7001

S435.112+.9

A

1001-7216(2017)04-0432-09

2017-01-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371920)。

修改稿收到日期：2017-03-29