轉(zhuǎn)cry1Aa基因抗蟲棉整合結(jié)構(gòu)解析及轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法的建立

王葉，謝家建，黃春蒙，彭于發(fā)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所／植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全及植物抗性監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京），北京100193）

轉(zhuǎn)cry1Aa基因抗蟲棉整合結(jié)構(gòu)解析及轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法的建立

王葉，謝家建*，黃春蒙，彭于發(fā)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所／植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全及植物抗性監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京），北京100193）

【目的】cry1Aa基因是2011年本實(shí)驗(yàn)室在我國棉花商品種子中發(fā)現(xiàn)的1種未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分，本研究旨在通過整合結(jié)構(gòu)解析，建立特異性檢測方法，對市售棉種進(jìn)行初測，明確該外源基因在我國棉種中的存在情況。【方法】通過Genome walking、長鏈PCR分離獲得了轉(zhuǎn)cry1Aa基因棉花轉(zhuǎn)化體（定名為NN6轉(zhuǎn)化體，簡稱NN6）的外源基因整合結(jié)構(gòu)，同時(shí)基于插入位點(diǎn)基因組及外源DNA連接區(qū)，建立了NN6轉(zhuǎn)化體特異性的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法?！窘Y(jié)果】NN6整合結(jié)構(gòu)主要包括cry1Aa、aad和NptII基因，插入棉花基因組7號(hào)染色體37 169 450位，產(chǎn)生91 bp基因組缺失；所構(gòu)建的定性PCR檢測方法能特異、快速地對棉花單株和種子單粒中NN6轉(zhuǎn)化體的純／雜合狀態(tài)進(jìn)行鑒定，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測限為44拷貝，能滿足國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的需要；對含有cry1Aa基因的3個(gè)市售棉種進(jìn)行檢測，其純合度分別為1.51%，5.21%和21.09%?！窘Y(jié)論】本研究解析了NN6的整合結(jié)構(gòu)，并建立特異性檢測方法，為我國轉(zhuǎn)基因棉花新品種選育及轉(zhuǎn)基因安全管理提供技術(shù)手段。

轉(zhuǎn)基因棉花；NN6轉(zhuǎn)化體；cry1Aa基因；定性PCR；定量PCR

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是繼轉(zhuǎn)基因玉米和大豆之后的第三大轉(zhuǎn)基因作物，轉(zhuǎn)基因棉花在我國已經(jīng)有20年的種植歷史。盡管近年我國棉花種植面積有所下降，但轉(zhuǎn)基因棉花種植比例卻保持在95%以上[1]。當(dāng)前我國大面積推廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種主要包括含cry1Ab/Ac融合基因的國抗系列、中棉所系列以及由孟山都公司研發(fā)cry1Ac基因的MON531及其衍生品種。此外，我國還批準(zhǔn)抗蟲的MON15985（轉(zhuǎn)cry1Ac和cry2Ab基因）、COT102（轉(zhuǎn)vip3Aa基因），耐除草劑的MON88913、1445、GHB614、LLCotton25以及抗蟲耐除草劑的GHB119、T304等轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)口作為加工原料[2-4]。2011年孫爻等在我國棉花種子中發(fā)現(xiàn)了 1種含有cry1Aa基因的新轉(zhuǎn)基因成分，建立了cry1Aa基因表達(dá)盒特異性檢測方法[5]。2013年該檢測方法被確定為國家檢測標(biāo)準(zhǔn)[6]，并作為我國轉(zhuǎn)基因棉花安全性評價(jià)過程中篩查未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分的方法之一。這種含有cry1Aa基因的轉(zhuǎn)基因棉花在國外批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因棉花中未見報(bào)道，其轉(zhuǎn)基因整合結(jié)構(gòu)并不十分清楚，轉(zhuǎn)化體特異性的檢測方法也尚無報(bào)道。

轉(zhuǎn)化體特異性檢測是基于受體基因組和外源基因連接區(qū)域序列所構(gòu)建的方法，較篩查檢測、基因檢測和構(gòu)建檢測具有更高的特異性，用于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的身份鑒定，廣泛運(yùn)用于多種轉(zhuǎn)基因作物的特異性檢測[7]。在轉(zhuǎn)基因棉花中，已經(jīng)建立了多個(gè)材料的轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法。汪巧等分離我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉鄂雜棉1號(hào)的旁側(cè)序列，并建立其轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR（Polymerase chain reaction）檢測方法[8]；楊陽等獲得了轉(zhuǎn)基因棉花MON757整合結(jié)構(gòu)，并建立轉(zhuǎn)化體特異性的純／雜合PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法[9]；汪秀秀等建立抗蟲耐除草劑棉花GHB119品系特異性定量PCR檢測方法[10]；Yang等構(gòu)建了適用于耐除草劑轉(zhuǎn)基因棉花MON1445和抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花MON531的雙重PCR檢測方法[11]；Jiang等針對MON15985轉(zhuǎn)基因棉花及其衍生物構(gòu)建了定性、定量PCR方法[12]。

通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)化體在宿主基因組的存在狀態(tài)與物種的基因型分類類似，可分為3種類型：純合體、雜合體、非轉(zhuǎn)基因。及時(shí)、快速、準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)化體的純／雜合狀態(tài)，是轉(zhuǎn)基因品種培育的重要基礎(chǔ)之一?；谵D(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)兩側(cè)基因組及外源DNA序列，構(gòu)建純／雜合鑒定方法，不僅省時(shí)省力，而且能充分利用子代的寶貴資源[13]。本研究通過染色體步移 （Genome walking）、長鏈PCR等方法，在cry1Aa基因序列的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分離獲得了NN6轉(zhuǎn)化體的整合結(jié)構(gòu)全長序列。在此基礎(chǔ)上建立了特異性的純／雜合定性PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，并對部分陽性樣品的轉(zhuǎn)基因純合度進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有cry1Aa基因的南農(nóng)6號(hào)F1種子材料2010年購于江蘇省市場[5]。為了獲得純合、雜合、非NN6種子材料，2011年起種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊試驗(yàn)基地，自交繁殖留種，通過子代cry1Aa基因的分離情況分析親代的純/雜合狀態(tài)，若子代不發(fā)生分離，則親代為純合，若發(fā)生分離則為雜合。測試材料異優(yōu)7號(hào)F1、泗優(yōu)1號(hào)、路棉6號(hào)F1（均為商品名）等40個(gè)轉(zhuǎn)基因棉種分別購自湖北省、江西省棉花種子市場。

1.2 DNA提取

參考轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抽樣標(biāo)準(zhǔn)[14]，在0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的檢出限上，定量測試樣品異優(yōu)7號(hào)F1、泗優(yōu)1號(hào)和路棉6號(hào)F1，分別隨機(jī)取樣600粒，充分研磨、混勻；棉花單株葉片組織或單粒種子樣品，則分別置于2.0 mL離心管，用組織研磨儀充分研磨。按照植物基因組DNA提取試劑盒操作手冊提取棉花種子或葉片基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 （膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%，1×TAE緩沖液）檢測DNA完整性，采用Thermo Scientific NanoDrop2000微量分光光度計(jì)測定其純度和濃度。

1.3 NN6轉(zhuǎn)化體整合結(jié)構(gòu)解析

根據(jù)已報(bào)道的MON531整合結(jié)構(gòu)及cry1Aa基因構(gòu)建，參照蘇長青等[15]結(jié)構(gòu)解析方法，按以下步驟獲得 NN6轉(zhuǎn)化體的整合結(jié)構(gòu)：（A）采用Genome walking方法分離獲得了整合結(jié)構(gòu)的5'端基因組旁側(cè)序列；（B）采用長鏈PCR方法獲得3'端旁側(cè)序列和結(jié)構(gòu)；（C）通過PCR測序法測定和驗(yàn)證內(nèi)部整合結(jié)構(gòu)。

1.4 定性PCR檢測方法的建立

基于轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)基因組及外源DNA片段，在5'端、3'端棉花基因組分別設(shè)計(jì)上游引物NN6-GF、下游引物NN6-GR，在轉(zhuǎn)基因插入序列5'端設(shè)計(jì)下游引物NN6-TR（圖1），由3條引物組成雙重PCR（引物由Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)，序列見表1）。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中GoTaq?GreenMaster Mix10 μL，7 μL ddH2O，引物各1 μL（10 μmol·L－1），DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的擴(kuò)增 （膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，1×TAE緩沖液）。

圖1 NN6轉(zhuǎn)化體檢測引物和序列示意圖Fig.1 Diagram of primer/probe and sequence used in the detection of NN6 event

表1 定性、定量PCR檢測引物/探針信息Table 1 Primer/probe information for qualitative and quantitative PCR detection

在苗期單株取樣，提取基因組DNA，運(yùn)用建立的定性PCR方法鑒定NN6轉(zhuǎn)化體的純、雜合情況。選擇雜合單株，經(jīng)單花自交后，收獲子代種子，隨機(jī)選取30粒種子，分析其NN6轉(zhuǎn)化體純合、雜合分布情況。

采用孫爻等的方法[5]對2015年從湖北省、江西省收集40份棉花種子進(jìn)行鑒定，其中有3個(gè)含有cry1Aa基因構(gòu)建成分：異優(yōu)7號(hào)F1、泗優(yōu)1號(hào)和路棉6號(hào)F1。3份棉花材料各隨機(jī)抽取60粒種子，單粒提取DNA，以定性PCR方法分別鑒定其NN6轉(zhuǎn)化體的純合／雜合狀態(tài)，參照國家標(biāo)準(zhǔn)[16]計(jì)算NN6轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因純合度（C）。公式：C=（N1+N2/2）/60×100%.式中，N1為純合NN6轉(zhuǎn)化體數(shù)量，N2為雜合NN6轉(zhuǎn)化體數(shù)量。

實(shí)踐性教學(xué)就是要求教師構(gòu)建自己的教學(xué)理論，將自己的實(shí)踐理論化，在實(shí)踐中不斷完善和發(fā)展。實(shí)踐性的核心是教師的職業(yè)敏感性。教學(xué)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展不可能一成不變。在教師的日常教學(xué)中，教師應(yīng)當(dāng)能夠?qū)⒔虒W(xué)實(shí)踐理論化，將教學(xué)理論實(shí)踐化[5]。外語教學(xué)專家要尊重教師積累的經(jīng)驗(yàn)，并鼓勵(lì)教師觀察、反思自己的教學(xué)過程，將教學(xué)理論付諸于實(shí)踐的同時(shí)發(fā)掘自己的教學(xué)潛力。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立

體系與程序：在NN6轉(zhuǎn)化體的5'端基因組與外源 DNA連接區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物對NN6-QF/NN6-QR以及探針NN6-QP（序列見表1），探針5'端標(biāo)記FAM（Carhoxy fluorescein）熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ-1（Black hole quencher 1）熒光猝滅基團(tuán)。棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ACP1基因特異性引物對ACP-QF/ACP-QR和探針ACP-QP參照國家標(biāo)準(zhǔn)[17]，探針5'端標(biāo)記HEX（Hexachloro fluorescein）熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ-1熒光猝滅基團(tuán)。反應(yīng)體系為 20 μL：2×Premix ExTaqTMmix10 μL，ddH2O 6.1 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol·L－1），探針 0.5 μL （10 μmol·L－1），ROX Reference Dye 0.4 μL，模板DNA 1 μL。熒光定量PCR反應(yīng)采用兩步法進(jìn)行，程序?yàn)椋?5℃預(yù)熱2 min，95℃變性5 s,60℃退火延伸34 s，40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)于60℃收集。

標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建參照楊陽等[9]關(guān)于MON757轉(zhuǎn)化體的報(bào)道，將純合NN6轉(zhuǎn)化體DNA用ddH2O稀釋為5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別為100、10、1、0.5和0.1 mg·L－1。按照 100 ng棉花基因組折合44 000拷貝計(jì)算，每微升梯度樣品對應(yīng)的拷貝數(shù)為44 000、4400、440、220、44。以DNA模板拷貝數(shù)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值（Cycle threshold value，Ct）為縱坐標(biāo)建立NN6轉(zhuǎn)化體及棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ACP1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對3個(gè)陽性材料進(jìn)行NN6轉(zhuǎn)化體的純合度測定，設(shè)置3次重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和相對標(biāo)準(zhǔn)差。由于在棉花基因組中ACP1基因的拷貝數(shù)為2[17]，所以樣品中棉花基因組拷貝數(shù)為ACP1基因拷貝數(shù)的一半。因此，按照以下公式計(jì)算NN6轉(zhuǎn)化體的純合度（C）：C=（P1×2/P2）×100%.式中P1為NN6轉(zhuǎn)化體拷貝數(shù)，P2為ACP1基因拷貝數(shù)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NN6轉(zhuǎn)化體的整合結(jié)構(gòu)

從南農(nóng)6號(hào)F1獲得NN6轉(zhuǎn)化體整合位點(diǎn)全長 序 列 為 12 045 bp （GenBank登 錄 號(hào) ：KY348841），外源DNA插入到棉花基因組7號(hào)染色體37 169 450位，造成棉花基因組插入位點(diǎn)91 bp DNA缺失。采用Genome walking獲得5'端旁側(cè)序列，包含213 bp棉花基因組序列（位于37 169 238～37 169 450）及88 bp右邊界（Right border，RB）；運(yùn)用長鏈PCR方法測定載體重組區(qū)域的3'端旁側(cè)序列,包括位于37 169 541～37 171 328的棉花基因組及T-DNA左邊界（Left border，LB）序列；經(jīng)克隆測序、比對拼接獲得NN6整合結(jié)構(gòu)，由cry1Aa基因、3'(9)-O-氨基糖苷腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶基因（aad）和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptⅡ）以單拷貝閱讀框組成完整T-DNA，三者分別由380bp和75bp的FillerDNA依次連接（圖2）。

圖2 NN6轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)全序列測定示意圖Fig.2 Schematic diagram of whole insertion sequence analysis for NN6 event

2.2 定性PCR檢測方法

在不同區(qū)域設(shè)計(jì)引物組合，通過純合、雜合、非 NN6的 棉 種 測 試 發(fā) 現(xiàn) 引 物 NN6-GF/NN6-TR/NN6-GR能有效地鑒別出NN6轉(zhuǎn)化體的純／雜合狀態(tài)（圖3）。其中NN6純合體擴(kuò)增產(chǎn)生221 bp的單一條帶，NN6雜合體單株擴(kuò)增產(chǎn)生221 bp和162 bp的2條帶，不含NN6轉(zhuǎn)化體的個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)生162 bp的單一條帶。

圖3 NN6轉(zhuǎn)化體定性PCR檢測方法Fig.3 Qualitative PCR method for NN6 event

苗期對田間單株定性PCR鑒定表明，12個(gè)單株包含NN6轉(zhuǎn)化體的3種核酸類型：純合NN6、雜合NN6、非NN6（圖4），這一結(jié)果與通過后代種子分離比鑒定結(jié)果相一致。雜合單株單花自交種子檢測表明，30粒種子中含有純合NN6轉(zhuǎn)化體4粒、雜合NN6轉(zhuǎn)化體18粒、不含NN6轉(zhuǎn)化體9粒（圖5），說明該方法能準(zhǔn)確、快速地鑒定自交后代純合、雜合分離情況。這表明所建純／雜合定性PCR檢測方法在田間單株篩選和單粒檢測有較好的適用性。

圖4 苗期單株的NN6轉(zhuǎn)化體定性PCR檢測Fig.4 Evaluation of single seedling using qualitative PCR method of NN6 event

圖5 30粒雜合NN6自交單粒鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of 30 self-pollinated seeds of heterozygous NN6 cotton

對2015年從湖北省和江西省購入的40份轉(zhuǎn)基因棉種600?；鞓予b定發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)品種中含有NN6轉(zhuǎn)化體，分別為異優(yōu)7號(hào)F1、泗優(yōu)1號(hào)和路棉6號(hào)F1。3個(gè)棉種60粒種子定性PCR檢測表明，所構(gòu)建的PCR檢測方法能快速鑒定單粒種子中NN6轉(zhuǎn)化體的純／雜合狀態(tài)。通過轉(zhuǎn)基因純合度公式計(jì)算表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉種中NN6轉(zhuǎn)化體純合度分別為1.67%，5.00%和15.00%（表2）。

表2 3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品種中單粒定性檢測分析Table 2 Qualitative PCR assay for single seeds in three transgenic cotton varieties

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的構(gòu)建參照楊陽等[9]的報(bào)道，以NN6轉(zhuǎn)化體基因組DNA為模板，設(shè)置3次平行下的5個(gè)濃度梯度，建立的棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ACP1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=－0.288 8x+11.625 8，R2=0.999 4，擴(kuò)增效率E=94.45%（圖6-A），其中y為拷貝數(shù)的常用對數(shù)，x為Ct值。建立NN6轉(zhuǎn)化體標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=－0.296 1x+11.713 8，R2= 0.998 3，擴(kuò)增效率E=97.75%（圖6-B），以上2項(xiàng)數(shù)據(jù)均符合轉(zhuǎn)基因定量檢測相關(guān)準(zhǔn)則（R2≥0.98；120%≥E≥80%）。NN6轉(zhuǎn)化體擴(kuò)增曲線圖表明，該定量PCR方法在44拷貝水平的平均Ct值為34.040 5，相對標(biāo)準(zhǔn)差（Relative standard deviation）為0.21%，所建定量方法在44拷貝以上即可對目標(biāo)DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該閾值折合成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%（以體系加入100 ng基因組DNA計(jì)算），完全能夠滿足目前國際上轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)需要[18]。該方法的建立，一方面適用于田間單株或單粒種子的定性篩選，另一方面可對棉花混樣或初加工品中NN6轉(zhuǎn)化體進(jìn)行準(zhǔn)確定量，較定性PCR方法具有更廣泛的適用性。因此，該熒光定量PCR方法適用于NN6轉(zhuǎn)化體定量檢測。

采用所構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測2015年湖北省和江西省3份含有cry1Aa基因棉種的NN6轉(zhuǎn)化體純合度，結(jié)果表明NN6轉(zhuǎn)化體純合度依次為1.51%，5.21%和21.09%，相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.12%，1.49%和2.43%（表3），均在轉(zhuǎn)基因檢測的接受閾值（25%）內(nèi)，這一定量結(jié)果與60單粒定性PCR檢測所折合的純合度結(jié)果相近。

3 討論

整合結(jié)構(gòu)是轉(zhuǎn)基因作物分子特征的重要內(nèi)容，是其轉(zhuǎn)基因生物安全性評價(jià)“個(gè)案分析”和建立其特異性檢測方法的分子基礎(chǔ)。本研究在前期檢測到cry1Aa基因棉花材料的基礎(chǔ)上，分離獲得了NN6轉(zhuǎn)化體的完整外源基因整合結(jié)構(gòu)，為其檢測溯源和安全性評價(jià)提供了重要的技術(shù)資料。從NN6轉(zhuǎn)化體整合的T-DNA結(jié)構(gòu)看，基因元件的組成、順序和載體骨架構(gòu)成等與孟山都公司的MON531轉(zhuǎn)化體非常類似，推測NN6轉(zhuǎn)化體采用與MON531轉(zhuǎn)化體相同的載體構(gòu)建而成，只是抗蟲基因不同。NN6轉(zhuǎn)化體整合的T-DNA左右邊界相對完整，推測其是通過農(nóng)桿菌方法轉(zhuǎn)化而來的。

轉(zhuǎn)基因在生物體基因組中的存在表現(xiàn)為純合、雜合2種狀態(tài)，不同狀態(tài)下可能呈現(xiàn)出外源蛋白的差異表達(dá)及表型變化[19]。本研究針對NN6轉(zhuǎn)化體建立了純／雜合檢測的定性PCR方法，不僅適用于田間單株、種子單粒純／雜合鑒定，也適用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的品系鑒定。目前含有NN6轉(zhuǎn)化體的抗蟲棉在我國尚未獲得安全審批，在國外已經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因棉花中也未見報(bào)道。目前構(gòu)建cry1Aa基因特異性檢測方法也已列入安全評價(jià)篩查，因此本研究建立的轉(zhuǎn)化體特異性的定性PCR檢測方法能更進(jìn)一步地提高篩查的特異性和溯源。

本研究對2015年湖北省、江西省上市的轉(zhuǎn)基因棉花種子抽樣鑒定結(jié)果表明，40個(gè)材料中有3個(gè)檢出含有cry1Aa基因，相比于2011年孫爻等[5]的鑒定結(jié)果，含cry1Aa基因材料的比例有所下降，這表明將其列入轉(zhuǎn)基因成分篩查這一管理措施取得了一定的效果。從3個(gè)陽性棉種中NN6轉(zhuǎn)化體純度來看，NN6轉(zhuǎn)化體均處于較低水平，可能是由于育種親本的不同程度污染造成的轉(zhuǎn)基因混雜，因此在育種環(huán)節(jié)對親本加強(qiáng)檢測力度才能有效控制源頭。

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Amplification plot and standard curves of real-time PCR assay

表3 3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品種NN6轉(zhuǎn)化體的定量檢測Table 3 Quantitative PCR assay of NN6 event in three transgenic cotton varieties

4 結(jié)論

以市場轉(zhuǎn)基因棉種為材料分離獲得NN6轉(zhuǎn)化體，通過Genome walking、長鏈PCR分別解析其5'端、3'端基因組旁側(cè)序列，經(jīng)克隆、測序、拼接獲得完整整合結(jié)構(gòu)，包括cry1Aa、aad和nptⅡ基因?；诓迦胛稽c(diǎn)基因組及外源DNA連接區(qū)，建立NN6轉(zhuǎn)化體特異性的定性、定量PCR檢測方法，通過定性PCR可實(shí)現(xiàn)田間單株或單粒種子純／雜合鑒定，加快育種進(jìn)程；定量PCR檢測下限為44拷貝，可在此水平上實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花混樣或初加工品的定量檢測。運(yùn)用本研究建立的檢測方法對市場棉種進(jìn)行初測，在3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉種中獲得目的擴(kuò)增，其純合度為1.51%～21.09%。NN6轉(zhuǎn)化體的結(jié)構(gòu)解析和檢測方法構(gòu)建，可為我國轉(zhuǎn)基因棉花新品種選育及轉(zhuǎn)基因安全管理提供技術(shù)手段。

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Integrated Structure of the Modifiedcry1Aa Gene in Cotton and Its Event-Specific Detection

Wang Ye,Xie Jiajian*,Huang Chunmeng,Peng Yufa
(Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Inspection Test Center for Environmental Safety of Transgenic Crops and Plant Resistance(Beijing),Ministry of A-griculture,Beijing100193,China)

[Objective]We detected a modifiedcry1Aa gene in a Chinese cotton line in 2011.The objectives of this study were to establish a specific detection method applicable for commercial cotton varieties by integrating the results of structural analyses and to confirm the existence of the exogenous gene in cotton.[Method]The integrated structure of the modifiedcry1Aa gene (NN6)was determined by genome walking and a long-chain polymerase chain reaction(PCR).An event-specific qualitative PCR and a quantitative real-time PCR were established based on the linkage region between genomic DNA and the exogenous DNA of NN6.[Result]The NN6 structure mainly comprised thecry1Aa,aad,andnptII genes,which had been inserted into chromosome 7 at position 37 169 450,with a 91 bp deletion in the genome.The highly sensitive qualitative PCR was able to quickly identify the heterozygous and homozygous NN6.The limit of detection for the NN6-specific quantitative real-time PCR was 44 copies,which satisfied the requirements for analyzing Chinese and international cotton varieties.The seeds of three commercial cotton varieties carrying thecry1Aa gene were tested,with a resulting purity of 1.51%,5.21%,and 21.09%.[Conclusion] We analyzed the integrated structure of NN6 and established a specific detection method that may be useful for ensuring transgenic cotton can be bred safely in China.

transgenic cotton;NN6 event;cry1Aa gene;event-specific qualitative PCR;quantitative real-time PCR

S562.035

A

1002-7807（2017）04-0307-09

10.11963/1002-7807.wyxjj.20170628

2016-12-26

王葉(1993―)，男，碩士，1038580458@qq.com。*通信作者：jjxie@ippcaas.cn

國家科技重大專項(xiàng)——轉(zhuǎn)基因生物新品種培育(2016ZX08012-002)