HPLC-IT-TOFMS快速區(qū)分達(dá)格列凈中間體及其位置異構(gòu)體

黃 鈺，馬 格，尹欣馳，張 健，潘遠(yuǎn)江

(1.浙江大學(xué)電氣工程學(xué)院，浙江 杭州 310027；2.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310027)

HPLC-IT-TOFMS快速區(qū)分達(dá)格列凈中間體及其位置異構(gòu)體

黃 鈺1,2，馬 格2，尹欣馳2，張 健1，潘遠(yuǎn)江2

(1.浙江大學(xué)電氣工程學(xué)院，浙江 杭州 310027；2.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310027)

本研究采用高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-IT-TOF MS)對(duì)降糖藥達(dá)格列凈原料藥中間體5-溴-2-氯-4’-乙氧基二苯甲酮(化合物1)及其異構(gòu)體5-溴-2-氯-2’-乙氧基二苯甲酮(化合物2)進(jìn)行區(qū)分。在不同碰撞能量下，對(duì)[M+H]+和碎片離子繪制能量分辨曲線，依據(jù)高精確度質(zhì)荷比信息確定碎片離子的元素組成，并提出了可能的碎裂機(jī)理。結(jié)果表明：兩種異構(gòu)體的能量分辨曲線表現(xiàn)出明顯差異，化合物1的主要碎片離子為[M+H-C6H5OC2H5]+(m/z216.90)，化合物2的主要碎片離子為[M+H-C2H4O]+(m/z294.95)。推測原因可能是乙氧基取代位置的不同對(duì)質(zhì)子H遷移產(chǎn)生了不同的影響。該方法操作簡便、靈敏度高，在沒有對(duì)照品的情況下也能快速區(qū)分位置異構(gòu)體。

達(dá)格列凈；位置異構(gòu)體區(qū)分；高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-IT-TOF MS)；能量分辨曲線

達(dá)格列凈(dapagliflozin, ForxigaTM)是由百時(shí)美施貴寶和阿斯利康公司聯(lián)合開發(fā)的抗糖尿病藥物，用于治療Ⅱ型糖尿病。該藥分別于2012年11月、2014年1月在歐盟和美國上市[1]。達(dá)格列凈的作用機(jī)制是通過抑制鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)的合成，阻斷進(jìn)曲小管對(duì)葡萄糖的重吸收，增加葡萄糖在尿液中的排泄，從而降低血糖[2-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，達(dá)格列凈合成工藝中[5,6]，5-溴-2-氯-4’-乙氧基二苯甲酮(化合物1)是關(guān)鍵中間體，在其合成過程中往往伴隨著副產(chǎn)物5-溴-2-氯-2’-乙氧基二苯甲酮(化合物2)的生成[7]。達(dá)格列凈及化合物1和2的結(jié)構(gòu)式示于圖1?；衔?的存在將直接影響后續(xù)的合成進(jìn)程，進(jìn)而影響藥物的純度和質(zhì)量。但由于化合物1和2互為位置異構(gòu)體，在分離鑒定上有一定難度。因此，為提高達(dá)格列凈的用藥安全，達(dá)到有效控制質(zhì)量的目的，對(duì)化合物1和2進(jìn)行快速識(shí)別和鑒定具有重要意義。

核磁共振[8]和液質(zhì)聯(lián)用[9-10]是鑒定同分異構(gòu)體常用的分析手段。其中，核磁共振技術(shù)所需的樣品量較大，且對(duì)純度要求較高；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)則兼具高效液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)分析能力，具有快速、高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于同分異構(gòu)體化合物的研究。

質(zhì)譜能量分辨曲線是以不同的碰撞能量為橫坐標(biāo)，碎片離子豐度占該能量下該化合物產(chǎn)生的所有離子豐度總和的比值為縱坐標(biāo)建立的[11-13]。它能夠提供區(qū)分異構(gòu)體的裂解信息，特別是在沒有對(duì)照品的情況下，可以快速高效地區(qū)分異構(gòu)體[12-13]。Tai等[13]利用大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜研究了查爾酮化合物的裂解機(jī)理，并通過繪制能量分辨曲線對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分。Yin等[14]利用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜快速識(shí)別了米格列醇及其異構(gòu)體，其與benzoboroxole的反應(yīng)產(chǎn)物硼酸酯的能量分辨曲線表現(xiàn)出顯著差異，可以通過特征碎片離子進(jìn)行異構(gòu)體的快速識(shí)別。

圖1 達(dá)格列凈及化合物1和2的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of dapagliflozin and compounds 1&2

本工作擬采用HPLC-IT-TOF MS技術(shù)同時(shí)采集不同碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，繪制能量分辨曲線，快速區(qū)分達(dá)格列凈中間體及其位置異構(gòu)體。利用精確二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和能量分辨曲線，進(jìn)一步分析二者的質(zhì)譜裂解行為，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，希望為控制達(dá)格列凈原料藥的質(zhì)量提供有效途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與裝置

LC/MS-IT-TOF質(zhì)譜儀：日本島津公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；Milli-Q水純化系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；HPLC色譜柱：Capcell PAK C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，日本資生堂公司產(chǎn)品；PHS-3B型pH計(jì)：上海INESA科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸：均為色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：Milli-Q高純水；三氟乙酸、氫氧化鈉：美國Sigma公司產(chǎn)品。

三氟乙酸鈉聚合物調(diào)諧液的制備：分別配制0.1%三氟乙酸水溶液和10 mmol/L氫氧化鈉水溶液，取等體積的上述兩種溶液混合均勻，并用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 3.5后，加入等體積乙腈并混合均勻，即制得標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧液。

混合物樣品：由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成[5]；5-溴-2-氯-4’-乙氧基二苯甲酮標(biāo)準(zhǔn)品：阿達(dá)馬斯試劑公司產(chǎn)品?；旌衔飿悠泛蜆?biāo)準(zhǔn)品均需用甲醇溶液稀釋后進(jìn)樣。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Capcell PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈-甲醇溶液(3∶1，V/V)；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫程序：0～15.0 min(15%～70%B)，15.0～60.0 min(70%～90%B)；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式采樣；檢測電壓：1.77 kV；氮?dú)饬魉伲?.5 L/min；曲線脫溶劑管(CDL)溫度：200 ℃；氮?dú)饬魉賶毫Γ?00 kPa；離子累計(jì)時(shí)間：50 ms；碰撞氣體：高純氬氣；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量：10%、15%、20%、25%；一級(jí)質(zhì)譜采集質(zhì)荷比范圍：m/z150～450；二級(jí)質(zhì)譜采集質(zhì)荷比范圍：m/z94～400，前體離子設(shè)定為m/z338.97；高分辨質(zhì)量矯正：采用三氟乙酸鈉聚合物。

2 結(jié)果與討論

2.1混合物樣品的HPLC-IT-TOFMS結(jié)果分析

化合物1和2互為位置異構(gòu)體，由于其理化性質(zhì)相似，通常很難將二者有效分離。本實(shí)驗(yàn)通過條件優(yōu)化，最終確定以0.1%甲酸水溶液為A相，乙腈-甲醇溶液(3∶1，V/V)為B相進(jìn)行梯度洗脫。在該實(shí)驗(yàn)條件下，混合物的色譜圖和總離子流圖示于圖2。色譜峰的峰形和強(qiáng)度較好，目標(biāo)化合物在43.86 min開始出峰，峰A和峰B的保留時(shí)間分別為44.42 min和45.23 min，峰基有一定的重疊，但裸露的峰面積足夠用于高靈敏度的質(zhì)譜分析。

色譜峰A和峰B對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖3，二者的質(zhì)譜圖具有顯著差異。圖3a中碎片離子m/z294.951 8豐度最高，m/z216.909 8豐度最低；圖3b中碎片離子m/z216.903 9豐度最高，沒有出現(xiàn)碎片離子m/z294.95。因此，可以將這兩個(gè)碎片離子作為區(qū)分這對(duì)位置異構(gòu)體的特征碎片離子。

2.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)

為了歸屬圖2a中色譜峰A和峰B，將化合物1的標(biāo)準(zhǔn)品在正離子模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜解析，并在不同的碰撞能量下繪制能量分辨曲線，結(jié)果示于圖4?？梢园l(fā)現(xiàn)，峰A和峰B的能量分辨曲線表現(xiàn)出顯著差異。隨著碰撞能量增大，峰A的[M+H]+離子及m/z294.95碎片離子豐度變化趨勢較大，而峰B和化合物1標(biāo)準(zhǔn)品的[M+H]+離子及m/z216.90碎片離子豐度變化趨勢較大。能量分辨曲線直觀地體現(xiàn)了峰A和峰B所對(duì)應(yīng)的這對(duì)位置異構(gòu)體質(zhì)譜裂解行為存在差異，峰B和化合物1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜裂解行為一致。進(jìn)而判定峰A和峰B分別對(duì)應(yīng)化合物2和1。

圖2 混合物樣品的色譜圖(a)和總離子流圖(b)Fig.2 Chromatogram (a) and total ion chromatogram (b) of the mixture sample

圖3 色譜峰A(a)和B(b)在15%碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrums of chromatographic peak A (a) and peak B (b) under 15% collision energy

圖4 色譜峰A(a)、峰B(b)和化合物1標(biāo)準(zhǔn)品(c)的能量分辨曲線Fig.4 Breakdown curves of peak A (a), peak B (b) and standard compound 1 (c)

2.3碎裂機(jī)理分析

化合物1和2結(jié)構(gòu)的區(qū)別在于苯環(huán)上乙氧基的取代位置。二者的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。化合物1主要產(chǎn)生2種碎片離子a和c，化合物2主要產(chǎn)生3種碎片離子a、b和c。化合物1的乙氧基在苯環(huán)上為對(duì)位取代，此時(shí)主要發(fā)生乙氧基苯的中性丟失(ion c)，而當(dāng)乙氧基為鄰位取代(化合物2)時(shí)，主要丟失C2H4O(ion b)。質(zhì)子化的化合物1和2可能的碎裂途徑示于圖5。

推測化合物可能的碎裂機(jī)理，碎片離子a為乙氧基上甲基H遷移至O原子發(fā)生乙烯的中性丟失而產(chǎn)生；碎片離子b由乙氧基上的甲基H發(fā)生1-4H遷移到苯環(huán)上中性丟失環(huán)氧乙烷(C2H4O)產(chǎn)生；碎片離子c的形成過程中，質(zhì)子H首先發(fā)生1-4H遷移至苯環(huán)鄰位，然后進(jìn)行1-2H遷移丟失乙氧基苯。因此，當(dāng)乙氧基為鄰位取代時(shí)，由于位阻效應(yīng)，質(zhì)子H發(fā)生1-4H遷移難度增加，難以產(chǎn)生c離子。由于b、c兩種碎裂途徑的競爭，化合物1主要產(chǎn)生c離子，化合物2主要產(chǎn)生b離子。在兩種位置異構(gòu)體中，a離子豐度無明顯差異。[M+H]+離子可能的碎裂機(jī)理示于圖6。

表1 質(zhì)子化的化合物1和2碎片離子的IT-TOF MS/MS數(shù)據(jù)Table 1 Experimental data for the product ions of compounds 1&2 by IT-TOF MS/MS

圖5 質(zhì)子化的化合物1和2可能的碎裂途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathway of protonated compounds 1&2

圖6 [M+H]+離子可能的碎裂機(jī)理Fig.6 Proposed fragmentation mechanism of [M+H]+ ions

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-IT-TOF MS法快速、高效地區(qū)分了降糖藥達(dá)格列凈中間體(化合物1)及其位置異構(gòu)體(化合物2)?；衔?和2的能量分辨曲線具有顯著差異，這是因?yàn)橐已趸〈恢貌煌瑢?duì)質(zhì)子H的遷移造成不同的影響，導(dǎo)致了異構(gòu)體裂解行為的差異。當(dāng)乙氧基為鄰位取代時(shí)，由于位阻效應(yīng)使得碎片離子c不容易形成。該方法操作簡便、快速高效，能夠同時(shí)獲得化合物的色譜和質(zhì)譜信息，可對(duì)化合物進(jìn)行快速的定性鑒別和半定量分析，為控制達(dá)格列凈原料藥的質(zhì)量提供了方法參考。

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RapidIdentificationofDapagliflozinIntermediateandItsIsomerbyHPLC-IT-TOFMS

HUANG Yu1,2, MA Ge2, YIN Xin-chi2, ZHANG Jian1, PAN Yuan-jiang2

(1.CollegeofElectricalEngineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China；2.DepartmentofChemistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Dapagliflozin is a sodium-glucose co-transporter-2 (SGLT2) inhibitor for treating type Ⅱ diabetes. In the process of synthesizing dapagliflozin, 5-bromo-2-chloropheny-4’-ethoxyldiphenylmethanone (compound 1) is a key intermediate. According to the literatures, there is always by-product 5-bromo-2-chloropheny-2’-ethoxyldiphenylmethanone (compound 2) in the synthesis procedure of compound 1. Due to the similarities of the two isomers in physical and chemical properties, it’s difficult to separate and differentiate compound 1 and 2. As compound 2 affects the purity of dapagliflozin, it is of great importance to establish a method to rapidly distinguish compound 1 from compound 2. In this article, high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry (HPLC-IT-TOF MS) method was used to analyze compound 1 and 2. The samples were dissolved in methanol for direct injection. Under the optimized chromatographic conditions, good separation for the two isomers was obtained on a Capcell PAK C18 column (250 mm×4.6 mm×5 μm) with a mobile phase of water (0.1% formic acid) and acetonitrile-methanol (3∶1,V/V) at a flow rate of 0.6 mL/min. The target compounds were assayed by IT-TOF MS/MS in positive mode with the spray voltage set at 1.77 kV. The nitrogen flow was set at 1.5 L/min, and the capillary temperature was set at 200 ℃. The collision gas was helium. The ion atm/z338.97 was chosen as the target to perform MS/MS experiment, and the collision energies were set at 10%, 15%, 20% and 25%, respectively. The MS/MS results under different collision energies were gained simultaneously by setting events in parallel on IT-TOF mass spectrometer. In order to visually distinguish the two isomers, breakdown curves were mapped by [M+H]+and fragment ions. The breakdown curves of the two isomers show significant differences, which provided strong support in this study. In addition, the element compositions of the three product ions were also confirmed by IT-TOF MS. Loss of C2H2from the precursor ions of [M+H]+was observed in the MS/MS spectra of both the isomers. For compound 1, the major fragmentation pathway was loss of C2H5OC6H5from [M+H]+viaa 2-step proton transfer. While, for compound 2, [M+H-C2H4O]+via1-4 H shift fromortho-substituted ethoxy group to the benzene ring was found to be the major product ion. The difference in the fragmentation pathways of the two isomers may be due to the different substitution sites of the ethoxy groups. When the ethoxy group isortho-substituted, the 2-step proton transfer is quite difficult. As a result, it goes through loss of C2H4O mainly. The method is simple, effective and accurate, which is suitable for rapidly qualitative and semi-quantitative analysis of the isomers, and also can provide a reliable and effective technique for the quality control of dapagliflozin.

dapagliflozin; isomer identification; high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry (HPLC-IT-TOF MS); breakdown curve

2017-03-14;

2017-05-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21372199)資助

黃 鈺(1993—)，女(漢族)，四川自貢人，博士研究生，化學(xué)專業(yè)。E-mail: huangyu0402@zju.edu.cn

張 健(1980—)，男(漢族)，吉林遼源人，助理研究員，從事可靠性測試、儀器開發(fā)。E-mail: jianzhangzju@zju.edu.cn

潘遠(yuǎn)江(1966—)，男(漢族)，湖南武陵源人，教授，從事生物活性分子的質(zhì)譜研究。E-mail: panyuanjiang@zju.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0443-07

10.7538/zpxb.2017.0043