細(xì)胞膜色譜在線HPLC-IT-TOFMS聯(lián)用系統(tǒng)篩選分析射干中次野鳶尾黃素的抗EGFR活性作用

呂艷妮，付 佳，孔利云，韓省力，張 濤，賀浪沖

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061)

細(xì)胞膜色譜在線HPLC-IT-TOFMS聯(lián)用系統(tǒng)篩選分析射干中次野鳶尾黃素的抗EGFR活性作用

呂艷妮，付 佳，孔利云，韓省力，張 濤，賀浪沖

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061)

中藥射干具有多種藥理作用并得到廣泛研究，但對(duì)其抗腫瘤活性組分的研究較少。本研究建立了一種用于篩選射干中抗腫瘤活性組分的方法。利用高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)細(xì)胞制備細(xì)胞膜色譜柱，并通過(guò)十通切換閥與高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-IT-TOF MS)構(gòu)建成二維在線聯(lián)用系統(tǒng)。利用吉非替尼驗(yàn)證該系統(tǒng)的適用性，分子模擬對(duì)接實(shí)驗(yàn)研究活性組分與受體的相互作用方式，并利用MTT實(shí)驗(yàn)研究所篩選組分對(duì)EGFR細(xì)胞的體外抑制作用。結(jié)果表明，利用該系統(tǒng)可從射干總提取物中篩選出能夠作用于EGFR的活性成分，并鑒定為次野鳶尾黃素；次野鳶尾黃素與EGFR的相互作用方式與陽(yáng)性藥吉非替尼相似；在濃度為0.4～50 μmol/L范圍內(nèi)，吉非替尼、次野鳶尾黃素對(duì)高表達(dá)EGFR細(xì)胞的體外抑制作用具有劑量依賴性。EGFR細(xì)胞膜色譜在線HPLC-IT-TOF MS法有望成為從中草藥中發(fā)現(xiàn)潛在抗腫瘤候選藥物的有效方法。

細(xì)胞膜色譜；表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)；高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-IT-TOF MS)；次野鳶尾黃素；射干；抗腫瘤作用

中藥(traditional Chinese medicine, TCM)具有幾千年的歷史，毒副作用小，在中國(guó)已被用于治療各種慢性疾病[7]。射干(RhizomaBelamcandae)是鳶尾科射干屬植物射干的干燥根莖，具有清熱解毒、利咽消痰的作用，臨床上常用于治療咽喉腫痛、痰咳氣短等癥狀[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，從射干中分離出的鳶尾黃酮和鳶尾黃酮苷具有抑制血管生成活性，但其靶點(diǎn)尚不明確[9]。因此，亟需建立基于特定靶點(diǎn)的方法篩選中藥復(fù)雜體系中的活性化合物。

高通量篩選是新藥開發(fā)過(guò)程中尋找先導(dǎo)化合物的重要方法，如，直接基于受體或酶的篩選，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的虛擬篩選等[10]。細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography, CMC)是由賀浪沖教授和他的團(tuán)隊(duì)于1996年發(fā)明的一種新型色譜技術(shù)[11]。細(xì)胞膜色譜不僅具有色譜的分離能力，同時(shí)兼具生物活性，是一種從中藥復(fù)雜體系中篩選中藥活性成分的有效方法[12-13]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于鑒定復(fù)雜樣品。隨著質(zhì)譜儀的更新?lián)Q代，高分辨質(zhì)譜儀(如LC-IT-TOF MS)的出現(xiàn)及其廣泛應(yīng)用為未知樣品的鑒定提供了更準(zhǔn)確的方法[14]。多維液相色譜也已廣泛應(yīng)用于中草藥的分離鑒定[15]。

本研究擬利用高表達(dá)EGFR細(xì)胞，建立一種EGFR細(xì)胞膜色譜模型。通過(guò)十通閥將細(xì)胞膜色譜與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀構(gòu)成二維在線聯(lián)用系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于射干總提物中作用于EGFR的活性組分篩選，通過(guò)受體-配體對(duì)接實(shí)驗(yàn)以及體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證篩選結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與條件

HPLC-IT-TOF MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品，配有兩臺(tái)LC-20AD色譜泵、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A控制器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、電噴霧離子源(ESI)和LC/MS Solution工作站。

細(xì)胞膜色譜柱和HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)通過(guò)十通閥搭建成二維在線聯(lián)用系統(tǒng)。

一維色譜條件：EGFR細(xì)胞膜色譜柱；流動(dòng)相為超純水；紫外檢測(cè)器；吉非替尼檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，次野鳶尾黃素檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。

二維色譜條件：島津Shim-Pack VP-ODS色譜柱(150 mm×2.0 mm×5 μm)；流動(dòng)相為40%乙腈和60%冰醋酸水溶液；流速0.2 mL/min；二極管陣列檢測(cè)器。

色譜柱均置于37 ℃柱溫箱中。

金秋在即，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用肥開始熱銷。山東紅日化工股份有限公司加班加點(diǎn)生產(chǎn)肥料，以滿足農(nóng)作物生長(zhǎng)需求。 劉海青攝

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；霧化氣和干燥氣均為高純氮?dú)?，純?99.999%；霧化氣流速1.5 L/min；干燥氣壓力109 kPa；曲線脫溶劑管線(CDL)溫度200 ℃；加熱模塊溫度200 ℃；接口電壓4.5 kV；檢測(cè)電壓1.57 kV；碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)氣為高純氬氣，純度>99.999%；CID能量50%；離子累積時(shí)間30.0 ms；正負(fù)離子掃描模式，掃描范圍m/z50～1 000。

1.2主要材料與試劑

色譜硅膠(規(guī)格：ZEX-Ⅱ，5 μm，200 ?)：青島美高集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；射干中藥材：購(gòu)于西安藥材市場(chǎng)，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室牛曉峰教授鑒定為鳶尾科植物射干Belamcandachinensis(L.) DC. 的干燥根莖，屬道地藥材；吉非替尼：純度>98%，南京安格醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品；次野鳶尾黃素(批號(hào)：131204)：純度>98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈：均為色譜純，德國(guó)Meck公司產(chǎn)品；EGFR高表達(dá)的HEK293細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；實(shí)驗(yàn)用水：超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為分析純。

1.3樣品制備

將吉非替尼、次野鳶尾黃素對(duì)照品分別配制成1 g/L的儲(chǔ)備液，待分析時(shí)用甲醇稀釋至適宜濃度。對(duì)照品溶液應(yīng)新鮮配制，并于-20 ℃避光保存。

射干提取物的制備：將干燥的射干用藥部位粉碎，于60 ℃烘干1 h后，用8倍量的50%乙醇回流提取2 h，重復(fù)2次，合并提取液，減壓蒸餾得到棕黃色的固體，即為射干總提物。分析時(shí)用甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞膜色譜柱制備

EGFR高表達(dá)的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)條件：用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，在5%二氧化碳環(huán)境內(nèi)于37 ℃條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均取自對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到107個(gè)/mL時(shí)，收集培養(yǎng)液，并用胰酶消化細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，吹懸細(xì)胞，收集終止消化的細(xì)胞培養(yǎng)液與先前收集的培養(yǎng)液混合。將所得細(xì)胞懸液于4 ℃以1 000 g離心10 min，棄去上清液，所得沉淀物即為EGFR高表達(dá)的細(xì)胞。用生理鹽水將其離心清洗2遍，加入50 mmol/L的Tris-HCl溶液，超聲30 min破碎細(xì)胞。將懸液于1 000 g 4 ℃條件下離心，細(xì)胞膜懸浮在上清液中，收集上清液于12 000 g 4 ℃條件下離心20 min，所得沉淀即為細(xì)胞膜，用生理鹽水重懸，清洗1次。將細(xì)胞膜懸液在真空條件下加入到具支試管(內(nèi)含0.05 g已活化(105 ℃，30 min)的大孔硅膠)中，攪拌均勻后靜置過(guò)夜。次日，采取濕法裝柱得到EGFR細(xì)胞膜色譜柱。

1.5EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOFMS系統(tǒng)適用性

通過(guò)十通閥將EGFR細(xì)胞膜色譜柱與HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)構(gòu)建成二維在線聯(lián)用系統(tǒng)，利用陽(yáng)性藥吉非替尼考察EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)對(duì)活性組分的識(shí)別、分離、鑒定能力以及該系統(tǒng)的適用性。將5 μL 0.1 g/L吉非替尼進(jìn)樣分析，并將保留組分富集、切換進(jìn)入二維系統(tǒng)分析，重復(fù)進(jìn)樣5次，以二維富集組分的峰面積為指標(biāo)，考察富集的重現(xiàn)性。利用5次富集組分的峰面積得出富集后的平均峰面積，與直接進(jìn)樣的吉非替尼的峰面積相比，得出EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)的富集率。

1.6EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOFMS系統(tǒng)的應(yīng)用

利用已經(jīng)建立并驗(yàn)證的EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)對(duì)射干總提物進(jìn)行識(shí)別-分析-鑒定能夠作用于表皮生長(zhǎng)因子受體的活性組分。為了驗(yàn)證射干總提物中活性成分的識(shí)別-分析-鑒定結(jié)果，利用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)對(duì)所鑒定出的活性組分的對(duì)照品進(jìn)行分析，驗(yàn)證篩選結(jié)果。

1.7受體-配體分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

利用SYBYL-X1.1對(duì)陽(yáng)性藥物吉非替尼以及篩選出的活性組分與表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(PDB ID：2ITY)進(jìn)行分析，研究陽(yáng)性藥物吉非替尼以及篩選出的活性成分與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的打分值大小。采用優(yōu)化的鮑威爾方法[16]進(jìn)行分析。

1.8細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

利用MTT實(shí)驗(yàn)考察陽(yáng)性藥物吉非替尼以及篩選出的活性組分對(duì)高表達(dá)EGFR細(xì)胞增殖的抑制效果。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞濃度約為5×104個(gè)/孔。孵育24 h后，用不同濃度的陽(yáng)性藥物吉非替尼以及篩選出的活性組分干預(yù)細(xì)胞，48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，棄去上清后每孔加入150 μL DMSO，利用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定細(xì)胞的光密度值[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOFMS系統(tǒng)建立及適用性考察

圖1 應(yīng)用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)分析吉非替尼的結(jié)果Fig.1 Chromatograms of gefitinib using EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS method

利用十通閥將EGFR細(xì)胞膜色譜柱與HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)構(gòu)建成二維的EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)。采用陽(yáng)性藥物吉非替尼考察該系統(tǒng)的適用性，結(jié)果示于圖1。圖1a是吉非替尼在EGFR細(xì)胞膜色譜柱上的色譜圖，有明顯的保留組分R；圖1b為HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)直接分析吉非替尼的色譜圖；圖1c為保留組分R經(jīng)富集切換進(jìn)入HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)后的色譜圖，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為吉非替尼。將0.1 g/L吉非替尼進(jìn)樣5 μL，并將保留組分富集切換進(jìn)入二維分析，重復(fù)5次，以二維系統(tǒng)富集組分的峰面積為指標(biāo)，考察富集的重現(xiàn)性。計(jì)算得到富集組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.95%(n=5)；利用5次富集組分的峰面積得出富集后的平均峰面積，與直接進(jìn)樣分析吉非替尼所得的峰面積相比，得到EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)的富集率為81.1%。綜上所述，EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)能夠滿足識(shí)別-分析-鑒定的要求。

2.2聯(lián)用系統(tǒng)應(yīng)用——中藥活性組分篩選

利用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)對(duì)射干總提物進(jìn)行分析，結(jié)果示于圖2。圖2a是射干總提物的EGFR細(xì)胞膜色譜圖，圖中具有明顯的不保留組分R0和保留組分R1(保留時(shí)間約為8 min)；圖2b是射干總提物的直接HPLC-IT-TOF MS色譜圖；圖2c是射干總提物的保留組分R1經(jīng)富集切換至HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)的色譜圖，經(jīng)質(zhì)譜分析和分子式預(yù)測(cè)軟件推測(cè)可能為次野鳶尾黃素，其裂解方式示于圖3。

2.3篩選結(jié)果的驗(yàn)證

為驗(yàn)證2.2節(jié)的篩選結(jié)果，利用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)分析次野鳶尾黃素對(duì)照品，其結(jié)果示于圖4。圖4a表明，次野鳶尾黃素在高表達(dá)EGFR細(xì)胞膜色譜柱上有明顯的保留組分R(保留時(shí)間約為8 min)；圖4b是次野鳶尾黃素的直接HPLC-IT-TOF MS色譜圖；圖4c是保留組分R經(jīng)富集切換至HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)的色譜圖，質(zhì)譜鑒定為次野鳶尾黃素。

綜上所述，射干總提物中能夠作用于EGFR受體的活性組分經(jīng)過(guò)二維在線聯(lián)用系統(tǒng)的篩選、分析，鑒定為次野鳶尾黃素。

2.4受體-配體對(duì)接實(shí)驗(yàn)

受體-配體之間的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)通常用于預(yù)測(cè)配體與受體之間的結(jié)合位點(diǎn)以及配體和受體之間的親和力大小。本研究利用分子對(duì)接分析了吉非替尼和次野鳶尾黃素與EGFR蛋白的結(jié)合位點(diǎn)以及親和力大小。利用SYBYL-X1.1從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中選出EGFR酪氨酸激酶(PDB ID：1M17)，將吉非替尼和次野鳶尾黃素與EGFR酪氨酸激酶進(jìn)行自動(dòng)對(duì)接，結(jié)果示于圖5，次野鳶尾黃素與吉非替尼和EGFR的作用位點(diǎn)相同。

圖2 射干總提物應(yīng)用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)的分析結(jié)果Fig.2 Chromatograms of the total extract of Rhizoma Belamcandae using EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS method

圖3 次野鳶尾黃素質(zhì)譜裂解圖Fig.3 Mass spectral fragmentation pathway of irisflorentin

圖4 次野鳶尾黃素對(duì)照品應(yīng)用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系統(tǒng)的分析結(jié)果Fig.4 Chromatograms of irisflorentin using EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS method

注：a.吉非替尼；b.次野鳶尾黃素圖5 兩種化合物與EGFR(PDB ID：2ITY)分子對(duì)接結(jié)果Fig.5 Results of two compounds docking with EGFR (PDB ID：2ITY)

2.5細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

利用MTT實(shí)驗(yàn)研究吉非替尼和次野鳶尾黃素對(duì)高表達(dá)EGFR細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果示于圖6。在劑量0.4～50 μmol/L范圍內(nèi)，吉非替尼和次野鳶尾黃素對(duì)高表達(dá)EGFR細(xì)胞的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。體外抑制高表達(dá)EGFR細(xì)胞增殖能力強(qiáng)弱為吉非替尼>次野鳶尾黃素，此結(jié)果與吉非替尼和次野鳶尾黃素在高表達(dá)EGFR細(xì)胞膜色譜柱上的保留時(shí)間結(jié)果一致。

圖6 吉非替尼和次野鳶尾黃素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.6 Effect of gefitinib and irisflorentin on EGFR cell viability

3 結(jié)論

建立了一種EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)用于射干總提物中EGFR活性組分的篩選和鑒定。次野鳶尾黃素被證實(shí)是作用于EGFR受體的活性成分。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)和自動(dòng)對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明，吉非替尼和次野鳶尾黃素作用于相同的靶點(diǎn)；細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明，次野鳶尾黃素能抑制高表達(dá)EGFR細(xì)胞的增殖。該方法有望成為基于EGFR受體的中草藥中篩選抗腫瘤候選藥物的有效方法。

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EGFRAntagonismoftheIrisflorentinfromRhizomaBelamcandaeUsingCMC-Online-HPLC-IT-TOFMSSystem

LV Yan-ni, FU Jia, KONG Li-yun, HAN Sheng-li, ZHANG Tao, HE Lang-chong

(SchoolofPharmacy,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

RhizomaBelamcandae(Shegan), obtained from the dried rhizome ofBelamcandachinensis(L.) DC., is one of the most important traditional Chinese medicines (TCMs). It has many pharmacological effects, such as eliminating toxins, heat, phlegmand dyspnea, antiviral effect, anti-inflammatory, etc. In recent years, studies on Shegan were increasing, and reports showed that tectorigenin and tectoridin separated from Shegan had the activity of inhibiting angiogenesis, however, the targets which they act with were uncertain. Hence, screening receptor-specific components with anti-tumor effect from Shegan is necessary. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a part of the tyrosine kinase family of receptors responsible for intracellular signalling and cell growth, and overexpression of EGFR is associated with angiogenesis, invasion and metastasis of cancer cells. Cell membrane chromatography (CMC) has its history of more than 20 years, it was established in 1996 by professor He and his colleagues. As a kind of biological affinity chromatography, CMC has been developed and confirmed to be an effective method for screening bioactive components from complex systems. In this study, a two-dimensional online system was built to screen active compounds acting on epidermal growth factor receptor fromRhizomaBelamcandae. The first dimension was EGFR/CMC system, and the second was HPLC-IT-TOF MS system. Gefitinib was selected as the positive control drug to investigate the suitability of the EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS system. For the EGFR/CMC system, the EGFR HEK293 engineered cell line was cultured and used to prepare the EGFR/CMC column according to the wet packing method, after analysing total extracts of Shegan through the EGFR/CMC system, the retained fractions were switched to the second dimension for identification. Molecular docking assay was performed using the SYBYL-X1.1 software to determine the strength of binding between the screened components and EGFR, and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay were used to evaluate theinvitroinhibition activity of the target components. The screening results showed that irisflorentin fromRhizomaBelamcandaewas the targeted component which could specifically act on EGFR. Molecular docking assay showed irisflorentin could act on EGFR in similar manner with gefitinib as a positive control drug. The results of MTT assay showed gefitinib and irisflorentin inhibited high expressed EGFR cell growth in a dose-dependent manner from 0.4 to 50.0 μmol/L. These results indicated that EGFR cell membrane chromatography online high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight-mass spectrometry (EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS) system would be a useful method in drug discovery with natural medicinal herbs for searching potential anti-tumor candidates.

cell membrane chromatography; epidermal growth factor receptor (EGFR); high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight-mass spectrometry (HPLC-IT-TOF MS); irisflorentin;RhizomaBelamcandae; anti-tumor

10.7538/zpxb.2016.0203

2016-12-17;

2017-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(81503032、 81230079、81227802)；國(guó)家博士后基金項(xiàng)目(2015 M570844、2016 T90930)；陜西省博士后科學(xué)基金；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助

呂艷妮(1992—)，女(漢族)，陜西富平人，博士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: xl03130058@stu.xjtu.edu.cn

賀浪沖(1957—)，男(漢族)，陜西榆林人，教授，從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究及細(xì)胞膜色譜技術(shù)、理論及應(yīng)用研究。E-mail: helc@mail.xjtu.edu.cn

O657.63

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：1004-2997(2017)04-0425-08