轉基因苜蓿草KK179-2品系特異性實時熒光PCR檢測方法的建立

劉二龍，盧麗，呂英姿，蔣湘，李嘉琪，林學勤，杜雅萍，鄭高彬

（1.黃埔出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510730；2.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510623）

轉基因苜蓿草KK179-2品系特異性實時熒光PCR檢測方法的建立

劉二龍1*，盧麗2，呂英姿1，蔣湘1，李嘉琪1，林學勤1，杜雅萍1，鄭高彬1

（1.黃埔出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510730；2.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510623）

根據(jù)轉基因低木質素苜蓿草品系KK179-2 5’端外源插入序列與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列設計引物和探針，建立了KK179-2品系特異性實時熒光PCR檢測方法，并對其特異性、靈敏度及可重復性進行了測定。結果表明：建立的定量實時熒光PCR檢測方法特異性良好；標準曲線線性相關系數(shù)（R2）為0.99，擴增效率E為105%；檢測限為20拷貝，定量限為200拷貝。重復性實驗顯示本方法的標準偏差（SD）及相對標準偏差（RSD）都在可接受范圍內。綜上，建立的KK179-2品系特異性定量PCR檢測方法適于快速、準確、穩(wěn)定地對轉基因苜蓿草KK179-2品系進行檢測。

轉基因苜蓿KK179-2；品系特異性；定量實時熒光PCR

苜蓿是美國繼玉米、小麥、大豆后第四大農(nóng)作物，因其蛋白質含量約占總干草質量的17%～20%，是一種重要的飼料作物。轉基因苜蓿KK179-2是由孟山都公司和Forage Genetics International（FGI）共同開發(fā)的轉基因低木質素苜蓿品種，商品名為HarvXtraTM。KK179-2于2014年11月10日獲得美國農(nóng)業(yè)部（USDA）動植物衛(wèi)生檢疫局（APHIS）批準可在美國種植。目前批準用于食品及加工產(chǎn)品的國家為澳大利亞、加拿大、日本、墨西哥、新西蘭、韓國、美國七個國家（山東草業(yè)網(wǎng)，2014；Clive等，2014；國家質檢總局，2014）。木質素是維管植物細胞壁的重要組成成分，由于苜蓿木質素不易被消化，因而降低了苜蓿的營養(yǎng)價值，轉基因苜蓿品系KK179-2與傳統(tǒng)苜蓿相比，木質素最高可減少22%（ISSSA，2017；Health，2015）。2014年5月1日澳新食品標準局（FSANZ）批準轉基因苜蓿KK179-2可用于食品。KK179-2目前尚未獲得我國農(nóng)業(yè)部轉基因生物安全證書。

低木質素的苜蓿品系KK179-2在苜?；蚪M中插入了咖啡酰CoA甲基轉移酶（CCOMT）編碼序列（CCOMT是參與G型木質素生物合成路徑的酶），該片段引入的方式為反向重復序列，表達時可以產(chǎn)生雙鏈RNA，從而產(chǎn)生RNA干擾（RNAi），抑制內源CCOMT RNA的翻譯及CCOMT酶的水平，導致KK179-2的G木質素含量降低進而減少苜蓿木質素整體含量（ISSSA，2017；Health，2015；藺占兵等，2003）。

隨著國內對高品質牛奶需求的增強，目前我國進口苜蓿量逐年增加，轉基因監(jiān)管的風險也隨之增大。國內和歐盟暫未出臺KK179-2的官方檢測方法。本研究基于KK179-2的5’端外源插入片段與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列建立了轉基因苜蓿KK179-2品系特異性TaqMan實時定量熒光PCR方法，以滿足轉基因苜蓿KK179-2品系標識的需求。

1 材料與方法

1.1 材料轉基因玉米品系MIR162，轉基因玉米品系89034，轉基因玉米品系NK63，轉基因玉米品系BT11，轉基因大豆GTS40-3-2，轉基因大米Bt63，非轉基因大葉苜蓿、小麥、油菜籽、轉基因苜蓿J101和轉基因苜蓿J163由本實驗室購置及儲備。轉基因苜蓿KK179-2的陽性質粒由苜蓿內源基因acc部分片段和KK179-2的5’邊界序列共586 bp克隆入PUC57載體，轉化至感受態(tài)細胞TOP10進行保存。

1.2 試劑Premix Ex TaqTM（TaKaRa）；引物和探針由英濰捷基公司合成，稀釋成終濃度為10 μmol/L的工作液使用。植物DNA提取試劑盒DP302、質粒DNA提取試劑盒購自天根公司。

1.3 儀器ABI7500，ABI75000FAST實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）、微量分光光度計（nanodrop2000c，美國）、研磨機（IKA，德國）。

1.3 方法

1.3.1 植物材料以及混合樣品基因組DNA的提取與純化按照天根DNA提取試劑盒操作說明書提取DNA，用微量分光光度計nanodrop2000c測定其濃度。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物和探針設計轉基因苜蓿KK179-2外源插入片段元件組成及序列見圖1和圖2（ISSSA，2017）。

圖1 轉基因苜蓿KK179-2品系外源插入片段示意圖

圖2 KK179-2 5’端鄰接區(qū)序列及引物探針在序列上的位置

基于KK179-2苜蓿5’端外源插入片段與苜蓿基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，使用Primer-EXpress 3.0軟件（AppliedBiosystems，USA）設計引物和探針。并將設計的引物和探針在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，確定引物和探針理論上的特異性。內源基因acc（acetyl CoA carboxylase）（Alexander，2007）引物和探針用于檢測苜蓿樣品基因組DNA是否成功提取以及是否適于進行實時熒光PCR擴增。序列信息詳見表1。

表1 引物和探針序列

1.3.3 實時熒光PCR反應體系實時熒光PCR檢測反應體系為20 μL：Premix Ex Taq TM 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，探針0.6 μL，DNA模板1 μL和ddH2O 7.4 μL。實時熒光PCR檢測的反應程序為：Stage1：預變性95℃30 s；Stage 2：95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

1.2.4 實時熒光PCR檢測方法的特異性提取轉基因玉米品系MIR162，轉基因玉米品系89034，轉基因玉米品系NK63，轉基因玉米品系BT11，轉基因大豆GTS40-3-2，轉基因大米Bt63，非轉基因大葉苜蓿、小麥、油菜籽、轉基因苜蓿J101，轉基因苜蓿J163和KK179-2陽性質粒的DNA，利用1.2.3體系和參數(shù)進行特異性檢測。

1.2.5 KK179-2的靈敏度測試及標準曲線建立將KK179-2質粒DNA溶液用TE緩沖液梯度稀釋至2×107～2×100拷貝/μL共8個濃度，按1.2.3實時熒光PCR反應體系進行擴增，每個濃度設置9個平行重復，以Ct≤36，且其RSD≤25%的最低稀釋度為定量下限（LOQ）。能100%檢出的最低稀釋度為檢測下限（LOD）。并由以上濃度梯度建立KK179-2品性特異性實時熒光PCR標準曲線，其擴增效率要求為90%～110%，R2≥0.98。

1.2.6 實時熒光PCR檢測KK179-2的可重復性測試將1.2.5中的2×105～2×102拷貝/μL 4組不同濃度的DNA擴增結果計算標準偏差（SD）和相對標準偏差（RSD）以進行可重復性分析。

2 結果與分析

2.1 引物和探針設計及體系建立對多組品系特異性引物和探針的反應效率、擴增曲線和擴增效果進行篩選和分析，最終選擇KK179-2-F/R/P引物和探針的序列見表1。

2.2 實時熒光PCR檢測KK179-2的特異性測試采用acc-1/2/p引物和探針對1.2.4中所有提取的材料DNA樣品進行實時熒光PCR擴增，只有苜蓿類的非轉基因大葉苜蓿、轉基因苜蓿J101、轉基因苜蓿J163和KK179-2質粒DNA來源的模板出現(xiàn)擴增曲線，其他無典型擴增曲線，表明苜蓿內源基因acc擴增結果正確（圖3 A），提取DNA模板質量符合實時熒光PCR要求。

采用KK179-2品系特異性引物和探針對1.2.4中12種材料所提取的DNA樣品進行實時熒光PCR擴增時，只有KK179-2質粒來源的DNA模板有典型熒光擴增曲線，其他作物的DNA模板均無典型擴增曲線（圖3 B）。說明本方法可特異性檢測KK179-2。

2.3 KK179-2的靈敏度測試及標準曲線建立將提取的KK179-2質粒DNA用TE緩沖液梯度稀釋至2×107～2×100拷貝/μL進行實時熒光PCR擴增，結果如表2所示。當模板量為200拷貝時，9個平行擴增反應均出現(xiàn)擴增，Ct值≤36，且標準偏差（SD）值為0.4，模板量為2拷貝時，無擴增曲線，所以本文建立的KK179-2品系特異性熒光PCR檢測方法的定量下限LOQ為200拷貝的KK179-2質粒DNA，LOD為20拷貝的KK179-2質粒DNA。

圖3 實時熒光PCR特異性測試

以2×107～2×100拷貝KK179-2質粒DNA為模板進行實時熒光PCR擴增，建立KK179-2品系特異性標準曲線，線性回歸方程為y=-3.2086x+42.426，線性相關系數(shù)（R2）為0.99，擴增效率E為105%（圖4C，D），表明標準曲線的線性良好，擴增效率良好，且標準曲線的R2大于0.98，均符合定量檢測標準曲線相關系數(shù)及擴增效率的要求（Engl，2014；Alexander，2007），因此說明本文建立的方法在2×107～2×100拷貝線性區(qū)間內適合于KK179-2的定量分析。

2.4 重復性測試由表2可知，4個10倍稀釋濃度梯度2×105～2×102拷貝的KK179-2陽性質粒DNA進行的擴增結果表明，4組9次平行重復Ct值的標準偏差（SD）為0.06～0.15，相對標準偏差（RSD）為0.18%～0.53%，均在可接受的范圍之內，表明本文建立的轉基因苜蓿KK179-2品系特異性實時熒光PCR方法具有很好的可重復性。

圖4 KK179-2品系特異性靈敏度測試擴增圖及標準曲線

表2 實時熒光PCR檢測KK179-2品系的重復性和靈敏度

3 討論

目前我國奶牛存欄數(shù)為1500萬頭，而國內的苜蓿產(chǎn)量及質量，不能滿足生產(chǎn)高檔牛奶的需求，苜蓿進口量逐年攀升。轉基因苜蓿通過飼料進入動物養(yǎng)殖的食物鏈，對食品安全存在潛在風險。為保障消費者的知情權，轉基因產(chǎn)品標識制度在30多個國家和地區(qū)應用，中國目前實施無閥值的強制性標識制度（Chief Medical Officer of the RussianFederation，2014；Gang等，2008；ECNO. 1829，2003；APEC-JIRCAS，2001；Ministry of Agriculture and Forestry of South Korea，2000）。

轉基因產(chǎn)品標識制度的實施需要建立相應檢測方法作為支撐。品系特異性檢測方法是基于外源插入片段和宿主基因接合區(qū)的邊界序列建立的檢測方法，目前被認為是最適合轉基因標識的檢測判定方法（Gang等，2008；Zimmermann，2000）。與其他篩選啟動子、終止子、抗生素標記基因和轉入目的基因不同，品系特異性檢測方法具有很高的特異性，對于相同質粒構建的不同品系也能很好的區(qū)分（Taverniers，2001）。目前已有多種轉基因作物品系如大豆、油菜、棉花、水稻和轉基因苜蓿等建立了相關的品系特異性檢測方法（劉二龍等，2015；劉欣等，2015；汪秀秀等，2014；蔣利平等，2013；Gang等，2008）。

目前對轉基因產(chǎn)品的檢測應用最廣泛的是熒光PCR檢測技術，相較普通PCR，其具更高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性?？赏ㄟ^熒光信號的積累實現(xiàn)實時監(jiān)測整個PCR進程，而后通過擴增曲線和標準曲線對未知模板進行定性或定量分析。

本文根據(jù)轉基因苜蓿品系KK179-2 5’端外源插入序列與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列設計引物和探針，建立的轉基因苜蓿KK179-2品系特異性實時熒光PCR檢測方法特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強、快速準確，適用于對轉基因苜蓿KK179-2進行品系特異性篩查，可為進境轉基因苜蓿的監(jiān)管提供有力技術支撐。

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To establish event-specific quantitative TaqMan real time PCR detection methods for genetically modified（GM）low-lignin alfalfa events KK179-2 the specific primer pairs and probe based on the 5’insert-to-plant junction sequence spanning the alfalfa genomic DNA and transgene insert DNA of KK179-2 were designed.The specificity，sensitivity and repeatability of this method were analyzed.Results showed that the developed quantitative realtime PCR detection method was specific for KK179-2.The correlation coefficient of standard curve was 0.99 and the efficiency of real time PCR was 105%.The limit of quantification（LOQ）and limit of detection（LOD）of this assay were 200 copies and 20 copies of KK179-2 plasmid DNA，respectively.Repeatability test of the established event-specific real time PCR method showed that the standard deviation（SD）and the relative standard deviation（RSD）were all in the acceptable range.Therefore，the established event-specific quantitative real time PCR method was suitable for fast，accurate and stable detection of GM alfalfa KK179-2.

genetically modified alfalfa KK179-2；event-specific；quantitative real time PCR

S816.17

A

1004-3314（2017）14-0031-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171408

廣東出入境檢驗檢疫局科技項目（2017GDK41、2016GDK60）

*通訊作者