槲皮素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性能和乳脂合成的影響

陳光明

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院，江蘇淮安223200）

槲皮素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性能和乳脂合成的影響

陳光明

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院，江蘇淮安223200）

為研究槲皮素對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性能和乳脂合成的影響，試驗(yàn)將乳腺上皮細(xì)胞分成5組，每組培養(yǎng)基中分別含有0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，然后在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果顯示：（1）細(xì)胞培養(yǎng)24 h和72 h時(shí)，與0 μg/mL槲皮素組相比，20 μg/mL和40 μg/mL槲皮素組細(xì)胞的活性分別顯著提高了13.12%、7.48%和7.83%、29.85%（P＜0.05）。（2）與0 μg/mL槲皮素組相比，20 μg/mL和60 μg/mL槲皮素組的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶（GSH-Px）活性以及一氧化氮（NO）濃度分別升高了15.52%、19.99%，53.49%、28.23%，36.29%、13.19%和30.42%、39.78%（P＜0.05），MDA含量分別降低了19.29%和32.74%（P＜0.05）。（3）與0 μg/mL槲皮素組相比，添加10 μg/mL槲皮素組細(xì)胞的SREBP1、CD36、FAS、PPAR-γ和SCD1基因表達(dá)分別顯著降低了45.00%、46.53%、26.73%、43.00%和29.00%（P＜0.05）。結(jié)果表明，槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化性能，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；并且能夠通過(guò)抑制脂肪酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)降低乳脂的合成。

槲皮素；奶牛；乳腺上皮細(xì)胞；乳脂

槲皮素，又稱(chēng)櫟精，呈黃色針狀結(jié)晶，屬于黃酮類(lèi)化合物，其廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中。研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雞的日糧中添加適量的槲皮素能夠調(diào)節(jié)蛋雞蛋白質(zhì)、鈣及脂質(zhì)的代謝；提高蛋黃蛋白質(zhì)和磷脂含量，降低蛋黃膽固醇和甘油三酯含量，進(jìn)而提高蛋品質(zhì)（劉紅南等2014；張琳等，2013）。另外，槲皮素能夠保護(hù)雞精原細(xì)胞免受氧化損傷；抑制雞脂肪合成代謝，進(jìn)而減少肉雞脂肪沉積以及對(duì)禽流感感染有一定的防治作用（李垚等，2013；潘德敏和羅開(kāi)健，2011；Mi等，2009）。歐陽(yáng)文文等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過(guò)調(diào)控cAMP信號(hào)通路抑制脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而降低脂肪沉積。王明昊等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)分泌因子TNF-α、ADP和PPAR-γ的生成，從而降低脂肪細(xì)胞TG含量。以上結(jié)果說(shuō)明，槲皮素具有抑制機(jī)體內(nèi)脂肪合成的作用。乳腺組織是乳脂合成的主要場(chǎng)所，其在乳腺上皮細(xì)胞中合成。本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究槲皮素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性能和乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，以此來(lái)了解槲皮素對(duì)乳脂合成的機(jī)制，為槲皮素在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料槲皮素（含量≥98%）由上海源葉生物科技有限公司提供。試驗(yàn)時(shí)，將槲皮素溶于二甲基亞砜（DMSO），培養(yǎng)基中DMSO含量為1‰。奶牛屠宰后，剪取乳腺組織，放入含雙抗的PBS中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，將純化的細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清（Gibco，美國(guó)）的DMEM/ F12（Gibco，美國(guó)）培養(yǎng)基中，在條件為37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞活性檢測(cè)細(xì)胞活性采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)，將細(xì)胞密度調(diào)整到8.0×104個(gè)/mL后接種到96孔板中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每組5個(gè)重復(fù)。細(xì)胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和72 h后，分別在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值，然后計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性。

細(xì)胞相對(duì)活性=（As-Ak）/（Ac-Ak）×100。

式中:As為試驗(yàn)組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+槲皮素）；Ac為對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）；Ak為空白組（培養(yǎng)基）。

1.2.2 抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)將細(xì)胞密度調(diào)整到1.0×105個(gè)/mL后接種到12孔板中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每組4個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行抗氧化酶類(lèi)如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量的檢測(cè)。所有指標(biāo)根據(jù)南京建成提供的試劑盒中的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取和Real Time-PCR條件取密度為2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞接種到6孔板中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每組4個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，然后進(jìn)行RNA提取，提取方法參照天根生化科技有限公司提供的試劑盒中的說(shuō)明書(shū)。RNA的濃度和純度經(jīng)過(guò)測(cè)定后，根據(jù)Takara試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上配制PCR反應(yīng)液，然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，其反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30 s；95℃、5 s，60℃、20 s，循環(huán)40次；65℃、15 s。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)根據(jù)Gene Bank中的基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），LSD法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對(duì)細(xì)胞活性的影響從圖1和圖2可知，奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，添加20 μg/mL和40 μg/mL槲皮素組的細(xì)胞相對(duì)活性分別較0 μg/mL槲皮素組顯著升高13.12%和7.48%（P＜0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)，與0 μg/mL槲皮素組相比，槲皮素組的細(xì)胞相對(duì)活性分別顯著升高了7.83%、20.35%、29.85%和12.13%（P＜0.05），其中40 μg/mL組細(xì)胞活性最高。結(jié)果表明，槲皮素能夠提高細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖1 槲皮素對(duì)培養(yǎng)24 h細(xì)胞活性的影響

圖2 槲皮素對(duì)培養(yǎng)72 h細(xì)胞活性的影響

2.2 槲皮素對(duì)細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響從表2中可知，與0 μg/mL槲皮素組相比，20 μg/mL和 60 μg/mL槲皮素組的SOD、CAT和GSH-Px活性以及NO濃度分別升高了15.52%、19.99%，53.49%、28.23%，36.29%、13.19%和30.42%、39.78%（P＜0.05），MDA含量分別降低了19.29%和32.74%（P＜0.05）。結(jié)果表明，槲皮素能夠提高細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)而可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表2 槲皮素對(duì)細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 槲皮素對(duì)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響從表3中可知，與0 μg/mL槲皮素相比，添加10 μg/mL槲皮素組細(xì)胞的SREBP1、CD36、FAS、PPAR-γ和SCD1基因表達(dá)分別顯著降低了45.00%、46.53%、26.73%、43.00%和29.00%（P＜0.05）。結(jié)果表明，槲皮素能夠降低與脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響乳脂的合成。

表3 槲皮素對(duì)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

陳靜（2012）研究發(fā)現(xiàn)，添加12.5～50 μmol/L槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活率，而添加100～200 μmol/L槲皮素則細(xì)胞的存活率降低。說(shuō)明槲皮素能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但添加劑量過(guò)高則會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。在本試驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h和72 h，槲皮素添加劑量在40 μg/mL之內(nèi)能夠提高細(xì)胞活性，而超過(guò)該劑量則細(xì)胞活性有所下降。本結(jié)果與陳靜研究結(jié)果相似。槲皮素添加劑量過(guò)高會(huì)降低細(xì)胞活性的原因可能是槲皮素發(fā)揮了抗雌激素的作用所致。

細(xì)胞在正常代謝情況下，會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），而體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)ROS水平，進(jìn)而使細(xì)胞免受ROS的損傷。如果細(xì)胞清除ROS能力下降，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷（楊麗娟和游育紅，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的SOD活性和降低MDA含量（陳靜，2012；李云峰等，2007）。另外，在過(guò)氧化氫刺激下，槲皮素能夠提高心肌細(xì)胞和PC12細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px活性和降低MDA含量，進(jìn)而提高細(xì)胞活性（劉紅亮等，2014；楊雷等，2006）。本試驗(yàn)所得結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，說(shuō)明槲皮素能夠提高細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)而提高細(xì)胞的生長(zhǎng)。NO能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞正常功能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝等。乳腺上皮細(xì)胞分泌的NO能夠增加乳腺血管中血流量，促進(jìn)泌乳（Vasudevan等，2016）。本試驗(yàn)結(jié)果看，添加適量槲皮素可能會(huì)增加NO的分泌來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。然而，NO含量過(guò)高，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加60 μg/mL槲皮素細(xì)胞的NO濃度最高，而抗氧化酶類(lèi)活性有所下降。說(shuō)明NO濃度升高，可能會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。

乳脂合成主要有兩部分，一是由乳腺上皮細(xì)胞所吸收的瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、β-羥丁酸等脂肪酸前體物質(zhì)在各種酶的催化下合成，另一個(gè)是乳腺?gòu)难褐蝎@取的脂肪酸。脂肪酸合成酶（FAS）能夠通過(guò)催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成甘油三酯，進(jìn)而調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成（羅建學(xué)等，2011）。硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）是多不飽和脂肪酸合成過(guò)程中的限速酶，通過(guò)敲除該基因發(fā)現(xiàn)，在高能日糧條件下小鼠采食增加，但體脂的沉積卻降低（張蕊等，2013）。分化抗原簇36（CD36）是一種跨膜糖蛋白，能與多種配基相結(jié)合，是長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在乳腺細(xì)胞攝取脂肪酸方面起到非常重要的作用。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是調(diào)控脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄因子。SREBP1高表達(dá)可導(dǎo)致FAS、ACC和PPAR-γ等基因的高表達(dá)（許會(huì)芬，2012）。敲除PPAR-γ可降低奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中SCD、SREBP1、FAS等基因表達(dá)量（Shi等，2013）。在本試驗(yàn)中，槲皮素降低了SCD1、SREBP1、FAS、CD36和PPAR-γ mRNA的表達(dá)。說(shuō)明槲皮素可能通過(guò)抑制SREBP1和PPAR-γ的表達(dá)來(lái)降低SCD1和FAS的表達(dá)，進(jìn)而降低脂肪酸的合成；另外，槲皮素可抑制CD36的表達(dá)，降低脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低乳脂的合成。

4 結(jié)論

槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)而提高細(xì)胞活性；另外，還可通過(guò)抑制脂肪酸合成酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，降低乳脂的合成。

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The objective of this study was to examine the effects of quercetin on antioxidant properties and milk fat synthesis of bovine mammary epithelial cell cultured in vitro.The bovine mammary epithelial cells were divided into 5 groups and cultured in medium with 0，10，20，40 and 60 μg/mL of quercetin，respectively.The cells of each group were cultured in a cell incubator of 37℃，5%CO2.The results showed as follows:（1）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the activity of cells cultured for 24 h and 72 h in the groups of 20 μg/mL and 40 μg/mL quercetin were increased by 13.12%，7.48%and 7.83%，29.85%，respectively（P＜0.05）.（2）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the activity of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），gluta thione peroxidase（GSH-Px）and the NO concentration in the groups of 20 μg/mL and40 μg/mL quercetin were increased by 15.52%，19.99%；53.49%，28.23%；36.29%，13.19%and 30.42%，39.78%，respectively（P＜0.05），the malonaldehyde（MDA）content were decreased by 19.29%and 32.74%，respectively（P＜0.05）.（3）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the relative express of SREBP1，CD36，F(xiàn)AS，PPAR-γ and SCD1 in the group of 10 μg/mL quercetin were decreased by 45.00%，46.53%，26.73%，43.00%and 29.00%，respectively（P＜0.05）.In conclusion，quercetin could increase the antioxidant ability of cells and promote cell proliferation，decrease the milk fat synthesis by inhibiting the expression of gene on the synthesis and transport of fat acid.

quercetin；dairy cow；mammary epithelial cell；milk fat

S816.7

A

1004-3314（2017）13-0016-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171304