清濕外洗湯質量控制研究

薛敏菲，雷凱君，吳舜芳，黃建明

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東佛山528000）

清濕外洗湯質量控制研究

薛敏菲，雷凱君，吳舜芳，黃建明

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東佛山528000）

目的建立兩煎常壓煎藥機所制清濕外洗湯的質量控制體系。方法采用薄層色譜法對清濕外洗湯中主要藥味梔子、黃柏、蛇床子進行定性鑒別；采用高效液相色譜法對清濕外洗湯中主要活性成分苦參堿進行含量測定，色譜柱為XTerra Rp18柱(250mm×4.6mm，5 m)，流動相為乙腈－乙二胺－水(45∶0.05∶55)，流速為1.0mL／min，柱溫35℃，檢測波長220 nm；觀察室溫下避光保存的湯劑，在擬訂的7 d儲存期內苦參堿含量的變化，同時進行微生物限度檢查。結果薄層色譜中均斑點清晰，無陰性干擾，分離度好，專屬性強?？鄥A質量濃度在0.029 5～0.177 0 g／L線性范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r＝0.999 8）；平均回收率為97.41%（n＝6）。于室溫下避光保存7 d苦參堿損失率為1.85%。結論該方法簡單易行，靈敏度高，重復性好，專屬性強，可用于清濕外洗湯的質量控制。兩煎常壓煎藥機煎煮的清濕外洗湯于室溫下避光保存7 d質量穩(wěn)定。

清濕外洗湯；苦參堿；薄層色譜法；高效液相色譜法；質量控制

目前，中藥行業(yè)從種植、藥品的（非）臨床試驗研究、生產加工再到調配都有著各自一套完整的質量控制體系，唯有湯劑煎煮環(huán)節(jié)缺少相應完備的標準操作規(guī)程。隨著現(xiàn)代化煎藥中心的不斷擴大，實現(xiàn)中藥代煎規(guī)范化操作及質量管理，是當今中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的當務之急。本研究中選取我院常用協(xié)定處方清濕外洗湯作為標準湯劑，其由苦參、梔子、黃柏、蛇床子等10多味中藥組方，具有清毒、燥濕、止癢等功效，用于治療濕熱蘊結引致的濕疹濕瘡、疥癬、陰腫陰癢等證。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對梔子、黃柏、蛇床子進行定性鑒別，高效液相色譜（HPLC）法對方中君藥苦參進行含量測定，為煎藥中心標準湯劑的質量控制提供可靠的實驗數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

YFML20型兩煎常壓煎藥機（北京東華原醫(yī)療設備有限責任公司）；Waters 1525型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AE－200型電子天平（瑞士METTLER公司）；HHS11－4型恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；101AS－4型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；ZF－90型暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）；TC－15型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

苦參堿對照品（批號為110713－200208），梔子苷對照品（批號為110749－200512），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713－200208），蛇床子對照藥材（批號為110822－200406），均由中國食品藥品檢定研究院提供；藥材由廣州致信藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)佛山市中醫(yī)院歐陽芳副主任中藥師鑒定為正品；乙腈（高效液相色譜法中使用的均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 清濕外洗湯的制備

按清濕外洗湯處方組成調配3副，按照最佳制備工藝條件：第1次煎煮時間為30min，第2次煎煮時間為20min，浸泡時間為30min，煎煮加水量為1 200mL，通過兩煎常壓煎藥機制成復方湯劑，每副湯劑量為300m L，分包裝成每袋150m L，標明湯劑名稱及試驗批號(批號為1，2，3)，室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 TLC鑒別

2.2.1 梔子[1－3]

取2.1項下備用湯劑20 m L，用正丁醇振搖萃取2次，每次25mL，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加無水乙醇1mL溶解，作為供試品溶液。同法取缺梔子陰性樣品制成陰性對照品溶液。另取梔子藥材1 g，加水30 mL，加熱回流提取30min，放冷，濾過，取濾液20mL，按照供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再精密稱取梔子苷對照品，加無水乙醇制成每1m L含4.0mg的溶液，作為對照品溶液。照2015年版《中國藥典(四部)》通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－乙酸乙酯－水（2∶1∶1）的上層溶液為展開劑，展開缸內預先放入氨水平衡，預飽和30min，展開，展距約10 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材及對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液色譜中無此斑點，見圖1。

2.2.2 黃柏[4－6]

圖1 薄層色譜圖

取2.1項下備用湯劑15 m L，用乙醚提取2次，每次15mL，棄去乙醚層，合并水層，用氯仿提取2次，每次15 m L，合并氯仿層，蒸干，殘渣加乙醇5 m L使溶解，乙醇液水浴濃縮至1 m L，作為供試品溶液。同法取缺黃柏陰性樣品制成陰性對照品溶液。另取黃柏藥材1 g，加水15m L，加熱回流提取30min，放冷，濾過，取濾液15 m L，按照供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再精密稱取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1m L含500μg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取上述供試品溶液5μL、對照藥材溶液3μL、對照品溶液3μL和陰性對照溶液5μL，分別點于用一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲苯－異丙烷－甲醇－濃氨（3∶6∶1.5∶1.5∶0.5）為展開劑，置氨蒸氣飽和的層析缸內，展開，展距約13 cm，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液色譜中無此斑點。見圖1。

2.2.3 蛇床子[7－9]

取2.1項下備用湯劑15 mL，加乙醚振搖提取2次，每次20mL。合并醚層，加飽和碳酸鈉溶液5mL振搖。棄去水層，使醚液揮至2 mL，作為供試品溶液。同法取缺蛇床子陰性樣品制成陰性對照品溶液。另取蛇床子對照藥材3 g，加水40m L加熱回流提取30 min，濾過，濾液加乙醚振搖提取2次，每次30mL。合并醚層，加飽和碳酸鈉溶液7.5m L振搖。棄去水層，使醚液揮至2mL，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取上述供試品溶液5μL、對照藥材溶液3μL和陰性對照溶液5μL，分別點于用一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－正己烷（15∶85）為展開劑，展開，展距約13 cm，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液色譜中無此斑點。詳見圖1。

2.3 苦參堿含量測定

2.3.1 溶液制備

精密量取2.1項下備用湯劑10mL，置分液漏斗中，加入2mL氨水，搖勻，再加氯仿提取4次，每次30mL，合并氯仿層，蒸干，殘渣加流動相使溶解，并轉移至10mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液，得供試品溶液。同法取缺苦參陰性樣品制成陰性對照品溶液。精密稱取苦參堿對照品適量，加流動相制成每1m L含59μg的對照品溶液。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：XTerra Rp18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相：乙腈－乙二胺－水(45∶0.05∶55)；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：220 nm；進樣量：10μL。理論板數(shù)以苦參堿峰計算應不低于2 000，見圖2。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：稱取苦參堿對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1m L含0.59 mg的對照品溶液。精密吸取上述溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分別置10m L容量瓶中，加流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，得標準系列溶液。分別進樣10μL，按擬訂色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，并以苦參堿質量濃度（X，g／L）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝1.80×106X－171.53，r＝0.999 8(n＝6)。結果表明，苦參堿質量濃度在0.029 5～0.177 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

圖2 苦參堿高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取同一苦參堿對照品溶液10μL，重復進樣6次，記錄苦參堿峰面積。結果的RSD為0.40%（n＝6），表明儀器精密度較好。

重復性試驗：取同一批號（批號為1）備用湯劑，平行制備6份供試品溶液，依法測定含量。結果苦參堿含量的RSD為1.05%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批號（批號為1）備用湯劑，依法制成供試品溶液。分別在室溫下0，2，4，8，12 h時進樣，測定苦參堿峰面積值。結果樣品含量分別為0.039 9，0.039 6，0.039 4，0.038 9，0.037 7 g／L，RSD為2.21%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密吸取已知苦參堿含量(質量濃度為0.039 7 g／L)的供試品溶液4mL，共6份，分別加入0.059 g／L的苦參堿對照品溶液3 m L，加流動相定容至10m L，用0.45μm的微孔濾膜過濾。精密吸取上述溶液各10μL進樣，依法測定含量。結果見表1。

表1 苦參堿加樣回收測定結果（n＝6）

2.3.4 樣品含量測定

分別取3個批號的藥材，按2.1項下方法制成湯劑，室溫下避光保存?zhèn)溆谩７謩e于制備后的1，3，7，10，15 d，按2.3.1項下供試品溶液的制備方法制備成供試品溶液。精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10μL，在擬訂色譜條件下測定，每批平行測定2份，以外標法計算各樣品中苦參堿的含量，并計算苦參堿的損失率。結果見表2。

表2 清濕外洗湯中苦參堿含量測定結果（n＝6）

2.4 微生物限度檢查

隨機抽取6批清濕外洗湯樣品，每批5袋，分別于室溫下避光保存的第1，3，7，10，15天檢查1次，每次1袋，肉眼觀察無變色、無結塊等改變后，照2015年版《中國藥典》通則1106微生物限度檢查法進行細菌和霉菌總數(shù)檢查，以及金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查。結果表明，常壓煎藥機所制清濕外洗湯室溫下避光保存15 d，仍符合藥品衛(wèi)生標準。

3 討論

3.1 定性鑒別

清濕外洗湯劑為復方湯劑，成分較復雜，對復雜的中藥劑型，薄層分析是行之有效的鑒別方法。本研究中鑒別梔子、黃柏和蛇床子均用對照藥材和（或）對照品同時作對照展開，通過多次試驗，斑點清晰，結果明顯，方法簡便，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好，具有專屬性，可以對該方中的這3味藥材進行有效鑒別，作為其是否存在的質量標準，達到本湯劑質量控制的目的。君藥苦參，由于與方中其他成分極性相似，暫未得出最佳分離條件，本試驗暫不列入定性鑒別項目，有待日后繼續(xù)研究。

在梔子薄層色譜鑒別中，曾用藥典方法丙酮－乙酸乙酯－甲酸－水（5∶5∶1∶1）作為展開系統(tǒng)[10]，但拖尾嚴重，分離效果不好，故改為文獻方法，效果較佳。在黃柏薄層色譜鑒別中，氨蒸氣的飽和程度是圖譜成敗的關鍵，其以蒸氣相的形式參與黃柏生物堿的分離，濃度不足明顯降低生物堿斑點的Rf值，甚至停留在原點，故濃氨溶液預飽和時間必須控制在30～45min[11]。

3.2 含量測定

供試品溶液苦參堿色譜峰的保留時間與對照品溶液色譜峰的保留時間一致，陰性對照品溶液在相同的保留時間處無色譜峰；且供試品溶液苦參堿色譜峰與其他組分峰分離完全，表明其他組分藥材對樣品中苦參堿的測定無干擾。通過HPLC進行含量測定，觀察含量變化，計算損失率，可知于制備第7天苦參堿含量下降為1.85%，由此判斷7 d內室溫避光保存，清濕外洗湯含量相對穩(wěn)定。

綜上所述，定性鑒別和含量測定方法的建立，加上微生物限度檢查，可有效控制兩煎常壓煎藥機所制清濕外洗湯的質量，為中醫(yī)藥臨床應用提供了科學、可靠的理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。

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Quality Control of Q ingshiwaixi Decoction

Xue Minfei,Lei Kaijun,Wu Shunfang,Huang Jianming
(Foshan Hospital of TCM,Foshan,Guangdong,China 528000)

Objective To establish a quality control system of Qingshiwaixi Decoction extracted by two fried normal pressure decocting machine.M ethods The main ingredients of Fructus Gardeniae,Cortex Phellodendri,Fructus Cnidii in Qingshiwaixi Decoction were identified by TLC,the content of main active ingredient matrine in Qingshiwaixi Decoction was determined by HPLC with XTerra Rp18column(250 mm×4.6 mm,5μm),acetonitrile－ethylenediamine－water(45∶0.05∶55)was used as mobile phase,the flow rate was 1.0 mL／min,the column temperature was set at 35℃,the wavelength of the detector was set at 220 nm.The content change of matrine was observed within 7 days at room temperature and avoided light,meanwhile,microbial limit test was carried out.Resu lts The TLC method had no negative interference,good separation and highly specificity with all the spots were clear.The linear range for matrine was 0.029 5－0.177 g／L(r＝0.999 8).The average recovery were 97.41%(n＝6).The content of matrine in Qingshiwaixi Decoction showed 1.85%decrease in the 7th day.Conclusion The method is simple,highly sensitive,highly repeatable and specific,it can be used for quality control of Qingshiwaixi Decoction.Qingshiwaixi Decoction can be kept stably at room temperature and avoided light lasting 7 days after it was extracted by two fried normal pressure decocting machine.

Qingshiwaixi Decoction;matrine;TLC;HPLC;quality control

R283.6；R284.1

A

1006－4931(2017)11－0009－04

2017－03－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.11.003

廣東省佛山市醫(yī)學類科技攻關項目[2016AB002051]。

薛敏菲，女，碩士研究生，主管中藥師，研究方向為中藥及其制劑質量標準研究，（電話）0757－83063171（電子信箱）68374812＠qq.com。