鎘柱還原法測定海水總氮方法的優(yōu)化及改進

時文博+王娟娟+王秀芹+王德興+王寶峰

摘 要：本文對海水總氮測定方法進行了優(yōu)化和改進，進行了鋅鎘還原和鎘柱還原的還原率比較研究，確定了緩沖液的pH值，進行了鎘柱還原樣品間棄去液問題的研究。本方法采用過硫酸鉀氧化，鎘柱還原后加入磺胺溶液，再加入鹽酸奈乙二胺溶液混勻，于543 nm波長下測定。方法繪制的標準曲線線性為y=0.738 6 x-0.016 6，相關(guān)系數(shù)r2>0.99?？瞻准訕藴y定回收率93.28%～104.93%，相對標準偏差3.87%。方法的精密度和準確度均較好，解決了原方法中標準曲線線性不穩(wěn)定、還原率較低、測量結(jié)果誤差較大的問題。

關(guān)鍵詞：鎘柱還原法；總氮；優(yōu)化

總氮（Total Nitrogen）是指水體中各種形態(tài)氮的總量，包括水中的無機銨鹽、溶解態(tài)氨、亞硝酸鹽、硝酸鹽及其他含氮的有機化合物，以每升水體中的氮含量來計算，是用來評價水質(zhì)及富營養(yǎng)化程度的重要指標之一。海水總氮含量增加可以使海水呈現(xiàn)富營養(yǎng)化狀態(tài)，微生物及浮游生物大量生長和繁殖，大量消耗水中的溶解氧，從而導(dǎo)致其他魚、蝦等水生生物死亡，破壞海洋生態(tài)環(huán)境，因此總氮的監(jiān)測顯得尤為重要。

目前，海水中總氮分析的常用方法是GB/T 12763.4-2007堿性過硫酸鉀氧化法[1]，其原理是海水樣品在110～120 ℃的溫度下和堿性環(huán)境中經(jīng)過過硫酸鉀氧化，其中的有機氮會被轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮。水中的亞硝酸鹽氮、銨態(tài)氮也會定量地被氧化為硝酸鹽氮。硝酸鹽氮經(jīng)鋅卷和氯化鎘的還原被還原為亞硝酸鹽氮，之后與磺胺發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再與鹽酸萘乙二胺作用，生成深紅色偶氮染料，于543 nm波長處進行分光光度測定。該方法操作方便，使用儀器設(shè)備少，所需試劑用量較少[2]。但此方法本身易受到環(huán)境等諸多因素的影響，因此對實驗條件、試劑等有著較高要求，經(jīng)常出現(xiàn)繪制標準曲線線性差、測定結(jié)果不穩(wěn)定的情況，給實際樣品測量造成困難[3-5]。

本研究的目的旨在通過實驗摸索和研究，對檢測方法進行優(yōu)化，改進實驗中還原步驟所用的還原劑，提高實驗精度和穩(wěn)定性，解決原方法中標準曲線線性不穩(wěn)定、還原率較低，測量結(jié)果誤差較大的問題。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗使用儀器及試劑

立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)）；UV-2550紫外-可見光分光光度計（日本島津公司生產(chǎn)）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司生產(chǎn)）；鋅卷用乙醇將所購鋅片擦拭干凈后剪成3 cm×5 cm的大小并卷成柱狀；鎘還原柱（國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心購買）柱長13 cm、柱徑12 mm。

1.0 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取20 g氫氧化鈉（NaOH）于1 000 mL的燒杯中，加入500 mL水后煮沸5 min，冷卻后移至500 mL容量瓶中，定容至刻線后貯于聚乙烯瓶中。

堿性過硫酸鉀溶液：稱取5 g過硫酸鉀（K2S2O8）溶解于50 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液中，用純水稀釋至100 mL。

氯化銨緩沖液：稱取13.0 g氯化銨（NH4Cl）溶解在水中，定容至1 000 mL，用氨水（NH3·H2O）調(diào)節(jié)pH值至8.5（使用pH計測定），配置后密封保存。

硝酸鉀標準溶液：準確稱取1.011 g經(jīng)110 ℃干燥1 h以上的硝酸鉀溶于水中，定容至100 mL，配成100 mmol/L的標準儲備液，使用時稀釋至1 mmol/L的標準使用液。

總氮標準溶液：c= 500 mg/L；總氮標準使用液：c=5.0 mg/L。移取總氮標準溶液 1 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至標線。

10 g/L 磺胺溶液；1.0 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液；實驗用水為Milli-Q超純水，所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

根據(jù)GB/T 12763.4-2007的步驟，將水樣中加入過硫酸鉀溶液后置入高壓蒸汽消煮器中加熱消煮，待壓力升至1.1 kPa（溫度120 ℃）時，控制壓力1.1 kPa～1.4 kPa（溫度120～124 ℃）并保持30 min。然后，放置使之自然冷卻，待壓力降至“0”后方可打開鍋蓋，取出樣品，將經(jīng)過消煮的水樣采取鋅鎘還原法和鎘柱還原法還原后，先加入磺胺溶液，再加入鹽酸奈乙二胺溶液混勻，于543 nm波長下，用1 cm測定池測定其吸光度。

2 海水中總氮測定方法的優(yōu)化

2.1 鋅鎘還原和鎘柱還原的還原率比較研究

配置不同鹽度下（鹽度分別為0‰、10‰、20‰、30‰、40‰）的含10.0 μmol/L硝酸鹽的人工海水與含10.0 μmol/L亞硝酸鹽的人工海水（鹽度為35‰）。取50 mL含硝酸鹽的人工海水加入50 mL氯化銨緩沖溶液混勻后，倒入鎘柱進行還原，接取經(jīng)過還原的流出液。取25 mL含硝酸鹽的人工海水加入0.5 mL氯化鎘溶液后加入一個鋅卷，迅速放入振蕩器振蕩10 min，取出鋅卷待測。將通過鎘柱還原法與鋅鎘還原法還原的溶液先加入0.5 mL磺胺溶液，再加入0.5 mL鹽酸奈乙二胺溶液并測定其吸光度。含亞硝酸鹽的人工海水使用相同步驟不經(jīng)過還原直接加入磺胺溶液，再加入鹽酸奈乙二胺溶液測定其吸光度，相對應(yīng)濃度的硝酸鹽溶液的吸光度與亞硝酸鹽溶液的吸光度的比值即為還原率。

經(jīng)過圖1、圖2的對比分析我們可以發(fā)現(xiàn)，鋅鎘還原法的還原率在低鹽度海水和高鹽度海水的測定中有很大的區(qū)別，鹽度為0‰時的平均還原率不到20%，因此實際實驗中若需測定低鹽度海水時，需要向溶液中加入氯化鈉增加其鹽度。同時可以看出，隨著鹽度的增大，鋅鎘還原法的還原率也隨之增加并穩(wěn)定，但總體的還原率仍然較低，平均只有 70%左右（69.18%～71.06%），并且6次平行測定之間的RSD較大，為4.55%～1024%。日常工作中發(fā)現(xiàn)，實驗所使用鋅卷的批次以及裁剪的偏差也會對實驗的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響，總體來看，此方法還原率較低且不穩(wěn)定。而鎘柱還原法的還原率不受鹽度的干擾，在鹽度0‰～40‰的范圍內(nèi)還原率基本保持在90%以上（91.46%～95.16%），并且6次平行測定之間的RSD為1.52%～3.05%，相對于鋅鎘還原法的RSD（4.55%～10.24%）低很多，說明此方法的穩(wěn)定性較好。同時實驗中同一根鎘柱可反復(fù)使用，減少了一定的系統(tǒng)誤差。

因此，將鎘柱還原法引入海水總氮測定之中，可以提高實驗精度和穩(wěn)定性。

2.2 緩沖液pH值的確定

鎘柱還原過程中需加入緩沖溶液以穩(wěn)定pH值，不同的pH值對還原率會產(chǎn)生一定的影響，而不同文獻和標準描述對調(diào)節(jié)緩沖液的pH值說法不一，需確定緩沖液的最佳pH值。

配置濃度為5 μmol/L硝酸鹽溶液使用稀鹽酸及氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值分別至3、4、5、6、7、8、9、10、11，取100 mL不同pH值的硝酸鹽溶液通過鎘柱還原后接取并測定其吸光度，不同pH值的樣品之間使用過量的超純水對鎘柱進行清洗，避免樣品之間的互相干擾，測定結(jié)果如圖3。

由圖3可見，從pH=3開始，隨著pH的上升，鎘柱的還原率不斷升高，至pH到達8～9之間達到最高（0.230～0.234），之后開始下降。因此為了使鎘柱的還率達到最佳，應(yīng)將緩沖液的pH值調(diào)節(jié)為8～9之間，建議將緩沖液的pH確定為8.5。

2.3 樣品間的棄去液問題研究

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，使用鎘柱還原法進行多個樣品測定時，若棄去液過少可能會出現(xiàn)串樣現(xiàn)象，上一個樣品的液體未全部排出鎘柱，下一個樣品已經(jīng)開始接取，導(dǎo)致樣品之間互相干擾，測定結(jié)果受到影響。

為了確定最佳的棄去液量，保證實驗的準確性，進行了棄去液量試驗。首先使用氯化銨緩沖溶液對鎘柱進行淋洗，之后取10.0 μmol/L的硝酸鹽溶液與氯化銨緩沖液混勻，通過鎘柱，測定之前和樣品之間分別加入過量的氯化銨緩沖液洗柱，若發(fā)生串樣則氯化銨緩沖液會干擾樣品導(dǎo)致樣品測定結(jié)果偏低，設(shè)置5個對照組，分別棄去流出液10、20、30、40和50 mL后，再依次接取25 mL流出液，加入磺胺及鹽酸萘乙二胺，測定吸光度。

結(jié)果顯示棄去液為10～40 mL時，測定吸光度為0.089～0.224，逐漸增大，棄去40～50 mL后，吸光度保持在0.224左右基本不變，說明前40 mL有串樣現(xiàn)象，因此建議進行多樣品測定時，后一個樣品接取前先棄去40 mL流出液，再接取測定。各個水樣間盡量將杯中液體放空，防止干擾后樣，但注意不要將空氣放入鎘柱，防止鎘粒被氧化。

2.4 優(yōu)化后方法的準確度及精密度

綜合上述實驗數(shù)據(jù)對總氮測定進行優(yōu)化，對優(yōu)化后的方法與原方法進行比較，根據(jù)GB/T 12763.4-2007的步驟，使用人工海水配置總氮濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的標準溶液系列。取25 mL標準溶液系列于100 mL具塞比色管中，加入4 mL堿性過硫酸鉀溶液，將水樣置入高壓蒸汽消煮器中加熱消煮，消煮后放置使之自然冷卻，待壓力降至“0”后方可打開鍋蓋，取出樣品。

樣品取出后用氯化銨緩沖液稀釋至刻線混勻，倒入鎘還原柱還原，接取25 mL流出液，加入0.5 mL磺胺溶液混勻，放置5 min后加入0.5 mL鹽酸奈乙二胺溶液，混勻于543 nm波長下，用1 cm測定池測其吸光度，繪制標準工作曲線。

使用優(yōu)化后的方法繪制的標準曲線線性為y = 0.738 6 x-0.016 6 相關(guān)系數(shù) r2 = 0.996 6，線性較好。

為了驗證使用優(yōu)化后方法進行測定的準確度和精密度，我們分別進行了質(zhì)控樣測定和空白加標實驗。質(zhì)控樣為自中國計量科學(xué)研究院購買，空白加標濃度為0.6 mg/L，結(jié)果見表1、表2。

由上述結(jié)果可以看出，使用該方法進行測定的質(zhì)控樣的值均在允許偏差之內(nèi)，并且6個并行樣之間的相對標準偏差為3.36%，符合要求。進行空白加標測定，加標量0.6 mg/L，測定結(jié)果的范圍為0.560～0.630，回收率93.28%～10493%，相對標準偏差3.87%，符合要求。證明所使用的方法的精密度和準確度均較好。因此證明，使用鎘柱還原優(yōu)化海水中總氮測定是切實可行的。

3 結(jié)論

將GB 17378.4-2007 中硝酸鹽氮測定方法中的鎘柱還原借鑒至總氮測定中，選擇鎘粒作為還原劑代替了鋅卷和氯化鎘溶液，并通過對方法的優(yōu)化，可以將原方法的還原率從70%左右提高至90%以上，在提高還原率的同時增強了實驗的穩(wěn)定性和可重現(xiàn)性。通過實驗驗證，方法優(yōu)化后繪制的標準曲線線性較好，方法的準確度、精確度均符合要求。同時避免了實驗中因穩(wěn)定性、可重現(xiàn)性差而導(dǎo)致的反復(fù)條件摸索，為實驗節(jié)約了時間。

鎘柱還原相較于鋅鎘還原的穩(wěn)定性更好，還原率更高，但實際試驗中應(yīng)注意緩沖液的pH值和樣品間棄去液的量都可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，造成實驗結(jié)果的偏差。通過實驗表明，氯化銨緩沖液的pH調(diào)節(jié)至8～9之間時可以保證鎘柱的還原率最高，連續(xù)樣品測定的過程中樣品之間應(yīng)棄去液達到40 mL或以上再進行接取測定就不會發(fā)生串樣導(dǎo)致樣品間的互相干擾。

參考文獻：

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Abstract：The method for determination of total nitrogen in seawater was optimized.The reduction rate was compared between zinc-cadmium reduction method and cadmium column reduction method. In cadmium column reduction method，the pH value of buffer solution was determined， and the optimum amount of waste liquid among samples was studied. In this method， after potassium persulfate oxidation and cadmium column reduction，sulfadiazine solution was added to the sample， and then hydrochloric acid ethylenediamine solution was added. After mixed evenly，absorbance of the sample solution was measured at 543 nm， and the standard curve linear was y=0.738 6x-0.016 6， with the correlation coefficient r2>0.99.The standard addition recovery was between 93.28%～104.93%，and the relative standard deviation was 3.87%.The precision and accuracy of the method are good， which solved some problems that exist in the original method such as the unstable standard curve， low reduction rate and relatively big measurement error.

Key words：cadmium column reduction method； total nitrogen； optimization

（收稿日期：2017-02-22）