慢性制動(dòng)應(yīng)激建立卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)小鼠模型的研究

申可佳++申奏秦旋++劉碧源++付靈梅+++熊桀

[摘要] 目的 探討慢性制動(dòng)應(yīng)激建立卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)小鼠模型的方法。 方法 利用自制制動(dòng)器對(duì)SPF級(jí)ICR雌性小鼠進(jìn)行制動(dòng)，造成慢性應(yīng)激狀態(tài)，觀察小鼠的一般情況，稱量體重，陰道涂片觀察動(dòng)情周期。制動(dòng)完全結(jié)束后進(jìn)行微刺激超排卵，在超排卵第3天和HCG注射后24 h計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡。 結(jié)果 與未制動(dòng)小鼠相比，制動(dòng)期間小鼠的進(jìn)食、毛色等一般情況變差，體重明顯減輕（P < 0.05），動(dòng)情周期異常的例數(shù)明顯增多（P < 0.05），但超排卵第3天和HCG后24 h小鼠各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)比較，制動(dòng)小鼠與未制動(dòng)小鼠沒(méi)有明顯區(qū)別（P > 0.05）。 結(jié)論 慢性制動(dòng)應(yīng)激可以引起小鼠卵巢功能紊亂或減退，但能否造成卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)還需進(jìn)一步探討。

[關(guān)鍵詞] 卵巢早衰；卵巢低反應(yīng)；慢性應(yīng)激；小鼠

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（b）-0019-04

Study on establishment of premature ovarian function and poor ovarian response mice model through chronic stress

SHEN Kejia SHEN Zouqinxuan LIU Biyuan FU Lingmei XIONG Jie

TCM University of Hu'nan， Hu'nan Province， Changsha 410208， China

[Abstract] Objective To explore the method of chronic immobilization stress which can establish the mice model of premature ovarian function （POF） and poor ovarian response （POR）. Methods Self-made brakes were used to make chronic stress stateon SPFICR female mice， during the general situation， body weight and estrous cycle of these mice were observed. The microstimulated super ovulation was used on the mice after immobilization， and the follicles of the mice were counted respectively on the third day of superovulation and 24 h after HCG injection. Results Compared with those in the non-immobilization mice， the general situation such as eating， hair color and so on were worse， the body weight significantly reduced （P < 0.05）， and the number of abnormal estrous cycle distinct increased （P < 0.05） in the immobilization mice during the braking period. But there was no obvious difference of the follicle number between the immobilization mice and the non-immobilization mice at various levels on the third day of superovulation and 24 h after HCG injection （P > 0.05）. Conclusion Chronic immobilization stress can causethe disorder or degradation of ovarian function，and further study is needed to find whetherit can cause premature ovarian function and poor ovarian response.

[Key words] Premature ovarian function； Poor ovarian response； Chronic stress； Mice

輔助生殖超排卵過(guò)程中卵巢對(duì)促性腺激素的刺激反應(yīng)低下稱為卵巢低反應(yīng)（POR），病因與年齡、遺傳和免疫、手術(shù)和感染、環(huán)境等因素相關(guān)，還有一類無(wú)明確病因可循，可能是因長(zhǎng)期壓力應(yīng)激導(dǎo)致卵巢功能衰退（特發(fā)性POF）而引起的POR在臨床也越發(fā)多見(jiàn)[1-4]。目前基礎(chǔ)研究大多為化療藥物、免疫及半乳糖等所致POF動(dòng)物模型，少見(jiàn)特發(fā)性POF/POR動(dòng)物模型[5-9]。本實(shí)驗(yàn)擬在模擬人類特發(fā)性POF的發(fā)病經(jīng)過(guò)，用重復(fù)制動(dòng)造成小鼠慢性應(yīng)激狀態(tài)，并在制動(dòng)結(jié)束后進(jìn)行超排卵，探討是否能建立POF/POR小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡健康SPF級(jí)ICR雌性小鼠80只和成年雄性小鼠20只，體重為22～25 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。實(shí)驗(yàn)遵循湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 超排卵藥物

來(lái)曲唑片（LE）：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H19991001。注射用尿促性腺激素（Gn）：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)H10940097；注射用絨毛膜促性腺激素（HCG）：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)H44020673。

1.1.3 儀器

自制制動(dòng)器：用50 mL塑料注射器改造而成，管壁上每隔5 mm左右用燒紅的探針戳穿，形成直徑約2 mm的小孔。TP-5000動(dòng)物稱重器：湘儀天平儀器廠；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus。

1.1.4 試劑

二甲苯，100%、95%、80%、70%乙醇，蘇木素，1%的鹽酸乙醇，1%的稀氨水，伊紅，中性樹(shù)膠，瑞氏染液。

1.2 方法

1.2.1 分組及制動(dòng)

6周齡ICR雌性小鼠80只，正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為四組，分別為模型組、西藥組、中藥組、正常對(duì)照組。稱量并記錄體重。模型組、西藥組、中藥組小鼠每上午放入制動(dòng)器內(nèi)制動(dòng)，共制動(dòng)14 d；每天制動(dòng)時(shí)間從3 h開(kāi)始，每天延長(zhǎng)0.5 h，至最長(zhǎng)制動(dòng)時(shí)間為每天6 h，造成小鼠應(yīng)激狀態(tài)；正常對(duì)照組不制動(dòng)。制動(dòng)第10天開(kāi)始至制動(dòng)第14天結(jié)束，每天陰道涂片并用瑞氏染色觀察小鼠動(dòng)情周期。正常的小鼠動(dòng)情周期為4～5 d，有四期規(guī)律的變化，分別為動(dòng)情前期（17～21 h）、動(dòng)情期（9～15 h）、動(dòng)情后期（10～14 h）和動(dòng)情間期（60～70 h）。若發(fā)現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂無(wú)規(guī)律交替，或在某期明顯延長(zhǎng)或持續(xù)停留在間期記為動(dòng)情周期異常，提示小鼠卵巢功能紊亂和/或減退[10-11]。第14天制動(dòng)結(jié)束后再次稱量所有小鼠體重。

1.2.2 給藥

1.2.2.1 各組小鼠均在第15天啟動(dòng)微刺激超排卵，具體方案為L(zhǎng)E+Gn+HCG，即先用LE 0.013 mg/d每日灌胃1次，共5 d；接下來(lái)用Gn 0.39 U/d每日腹腔注射1次共7 d，使用Gn最后1天傍晚雌雄鼠合籠，次日晨檢查陰栓，有陰栓者腹腔注射1次HCG（25.71 U/次）。

1.2.2.2 西藥組和中藥組在制動(dòng)期間分別使用干預(yù)卵巢低反應(yīng)的西藥和中藥（西藥組：第8～19天，每天1次生長(zhǎng)激素0.01 U/d腹腔注射，第15天開(kāi)始至處死日每天1次阿司匹林0.2 mg/d灌胃；中藥組第1天開(kāi)始至處死日每天1次護(hù)卵湯0.597 g/d灌胃，護(hù)卵湯組配方參考文獻(xiàn)[12]。模型組和正常對(duì)照組未使用干預(yù)治療藥物。

1.2.2.3 各組小鼠每天在相同時(shí)間段進(jìn)行相應(yīng)的藥物灌胃及腹腔注射，不使用藥物的小鼠用生理鹽水代替藥物，保證組間灌胃及腹腔注射操作一致。

1.2.3 標(biāo)本采集

每組小鼠在超排卵啟動(dòng)第3天上午脫頸椎處死10只，開(kāi)腹取出卵巢。每組余下雌鼠在注射HCG前1 d晚上與雄鼠以2∶1比例合籠過(guò)夜，次日早晨7：00檢查雌鼠，將有陰栓的雌鼠注射HCG，24 h后脫頸椎處死，開(kāi)腹取出卵巢。沒(méi)有陰栓的雌鼠繼續(xù)與雄鼠以2∶1比例合籠過(guò)夜，直至發(fā)現(xiàn)陰栓后，再按上述方法處理獲取卵巢。

1.2.4 卵泡計(jì)數(shù)

每組隨機(jī)8只小鼠的一側(cè)卵巢組織（左右隨機(jī)）用10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片后HE染色，高倍鏡下觀察。每組隨機(jī)選擇8張切片（不含連續(xù)切片），每張切片選取3個(gè)不同區(qū)域計(jì)數(shù)，將每組各張切片3個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)的各級(jí)卵泡數(shù)累積為每組原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡的總個(gè)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

正常對(duì)照組從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束外觀及活動(dòng)狀態(tài)均無(wú)異常，體重適度增加。其他組小鼠造模開(kāi)始后逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少，二便減少，行動(dòng)遲緩，四肢無(wú)力，毛色晦暗無(wú)光并出現(xiàn)不同程度的脫落，制動(dòng)結(jié)束后明顯較正常對(duì)照組瘦弱；制動(dòng)結(jié)束后到實(shí)驗(yàn)結(jié)束這段時(shí)間這些小鼠逐漸恢復(fù)進(jìn)食及二便，行動(dòng)變活潑，毛色恢復(fù)光澤，體重增加。

2.2 各組小鼠體重變化

在各組小鼠開(kāi)始制動(dòng)前、完全結(jié)束制動(dòng)后、HCG 24 h后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)稱量各組小鼠的體重。組間比較結(jié)果顯示：完全結(jié)束制動(dòng)后模型組、西藥組、中藥組小鼠體重均低于正常對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示制動(dòng)應(yīng)激對(duì)小鼠體重造成不良影響；HCG 24 h后西藥組和中藥組小鼠體重低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。組內(nèi)比較結(jié)果顯示：各組小鼠隨時(shí)間推移在制動(dòng)前、完全結(jié)束制動(dòng)后、HCG 24 h后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)體重逐步增加，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.3各組小鼠動(dòng)情周期變化

至制動(dòng)結(jié)束，模型組、西藥組、中藥組發(fā)生動(dòng)情周期異常的小鼠明顯多于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05），提示制動(dòng)實(shí)驗(yàn)使小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)卵巢功能有不良影響。見(jiàn)表2。

2.4 各組小鼠卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)量及比例

分別在超排卵第3天和HCG 24 h后獲取小鼠卵巢組織，結(jié)果顯示：四組小鼠卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表3～4。

3 討論

現(xiàn)代社會(huì)女性身兼家庭工作多重角色，承受的壓力越來(lái)越大，長(zhǎng)期焦慮、憂郁、憤怒等負(fù)面情緒作為應(yīng)激，不斷刺激下丘腦-垂體-卵巢軸，引起神經(jīng)內(nèi)分泌及卵巢功能紊亂，卵巢功能的受損引起女性生殖功能退化，出現(xiàn)月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)、不孕等等系列疾病，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量并加速機(jī)體衰老進(jìn)程。即使在輔助生殖技術(shù)如此發(fā)達(dá)的今天，仍有部分患者因卵巢功能衰退無(wú)法獲得足夠的高質(zhì)量卵子而失去生育的機(jī)會(huì)，給患者身心及社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的壓力。對(duì)于卵巢功能障礙，西醫(yī)多用激素替代治療及誘導(dǎo)排卵等方法，但療效不確切，副作用大且費(fèi)用昂貴，中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受關(guān)注[12-20]。所以本研究中，希望通過(guò)應(yīng)激模擬人類特發(fā)性POF發(fā)病經(jīng)過(guò)，建立相關(guān)的動(dòng)物模型，用以探討西醫(yī)和中醫(yī)在此方面的療效。

制動(dòng)（束縛）是最常用的身心應(yīng)激模型，本實(shí)驗(yàn)將50 mL注射器改造成制動(dòng)器，與實(shí)驗(yàn)小鼠的體型大小匹配，用燒紅的探針將針筒的前壁及側(cè)壁布滿小孔，以減少塑料管內(nèi)溫度升高，小鼠放入制動(dòng)器后堵住活塞使其活動(dòng)受限，但可進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)制動(dòng)的方法，每天制動(dòng)時(shí)間從3 h開(kāi)始，以后每天延長(zhǎng)0.5 h，至最長(zhǎng)制動(dòng)時(shí)間為每天6 h，使小鼠處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未制動(dòng)小鼠相比，經(jīng)過(guò)14 d慢性重復(fù)制動(dòng)處理的小鼠，無(wú)論是單純制動(dòng)的模型組，還是使用西藥或中藥干預(yù)的制動(dòng)西藥組、中藥組，在制動(dòng)期間進(jìn)食、活動(dòng)、精神、毛色等一般情況明顯變差，體重明顯減輕（P < 0.05），動(dòng)情周期紊亂及延長(zhǎng)/停滯的例數(shù)明顯增多（P < 0.05）。重復(fù)制動(dòng)作為慢性應(yīng)激，刺激下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸異常活化，使糖皮質(zhì)激素持續(xù)升高導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受損；同時(shí)在應(yīng)激中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的去甲腎上腺素不斷耗竭，導(dǎo)致抑郁樣癥狀的發(fā)生[21]。故本研究觀察到慢性應(yīng)激后小鼠活動(dòng)和進(jìn)食明顯減少、體重減輕、反應(yīng)遲鈍、皮毛枯燥，與各種抑郁癥狀相一致。高水平的糖皮質(zhì)激素會(huì)直接抑制性腺軸，導(dǎo)致促性腺激素釋放激素及促性腺激素分泌減少，同時(shí)卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)降低，最終影響卵巢的分泌功能[22-23]。卵巢分泌的雌激素減少導(dǎo)致血清中雌激素水平降低，雌激素的應(yīng)激性降低與動(dòng)情周期的應(yīng)激性變化高度相關(guān)。有報(bào)道慢性應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物血漿雌激素不同程度降低，部分動(dòng)物周期未受影響或性周期延長(zhǎng)但仍有規(guī)律，部分動(dòng)物血漿雌二醇在動(dòng)情前期的生理峰值進(jìn)一步降低或消失，陰道涂片結(jié)果表現(xiàn)為無(wú)規(guī)律或持續(xù)處于間期，與更年期大鼠一致[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性制動(dòng)應(yīng)激能導(dǎo)致大部分小鼠動(dòng)情周期異常，可建立卵巢功能紊亂或減退模型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]。

制動(dòng)完全結(jié)束后對(duì)各組小鼠進(jìn)行微刺激超排卵，于超排卵第3天和HCG 24 h對(duì)小鼠卵巢內(nèi)原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示制動(dòng)小鼠與未制動(dòng)小鼠之間各級(jí)卵泡數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），各制動(dòng)組小鼠之間也沒(méi)有明顯區(qū)別（P > 0.05）。小鼠各級(jí)卵泡中，原始卵泡數(shù)代表卵巢的儲(chǔ)備功能，與POF直接相關(guān)，竇卵泡數(shù)代表能發(fā)育為成熟卵泡的數(shù)量，與POF和POR直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠間各級(jí)卵泡數(shù)目沒(méi)有顯著差別，說(shuō)明未建立POF/POR小鼠模型。是否需要延長(zhǎng)應(yīng)激天數(shù)或改變應(yīng)激方式才能建立POF/POR動(dòng)物模型，據(jù)研究報(bào)道[11，25]，制動(dòng)前期小鼠對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)最明顯，一般不超過(guò)25 d，隨著應(yīng)激天數(shù)的增加，制動(dòng)14 d后小鼠逐漸對(duì)應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)，動(dòng)情周期恢復(fù)正常，故本實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)施制動(dòng)14 d而沒(méi)有繼續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。還有研究報(bào)道[11，22]通過(guò)束縛、冷熱刺激、被動(dòng)吸煙等多種慢性應(yīng)激的方法或重復(fù)制動(dòng)可導(dǎo)致大鼠卵巢功能紊亂，但只有部分大鼠出現(xiàn)POF，這些結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果方向一致，提示應(yīng)激方法不能得到穩(wěn)定的POF動(dòng)物模型，但是能得到穩(wěn)定的卵巢功能紊亂動(dòng)物模型。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這種動(dòng)物模型在超排卵刺激后沒(méi)有發(fā)生卵巢低反應(yīng)，故今后若研究卵巢低反應(yīng)相關(guān)疾病，選擇化療藥物或免疫因素造成POF或許更能成功建立POR動(dòng)物模型。

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（收稿日期：2017-03-14 本文編輯：蘇 暢）