急性呼吸道感染門診患者的臨床特征和病毒譜分析

林素挺　陳平　崔大偉

[摘要] 目的 分析急性呼吸道感染門診患者的臨床特征和病毒譜，為患者的臨床治療提供依據(jù)。 方法 收集2015年1月～2016年12月具有急性呼吸道感染癥狀的門診患者的臨床資料，并采集患者的咽拭子樣本。應(yīng)用多重PCR方法檢測15種呼吸道病毒，并利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)鑒別甲型流感病毒的3種常見亞型。 結(jié)果 465例門診患者中，呼吸道病毒陽性137例，檢出率為29.5%（137/465），其中單一病毒感染94.2%（129/137），病毒共感染5.8%（8/137）；單一病毒感染中，以流感病毒為主，其次為腸道；病毒共檢出中以鼻病毒和季節(jié)性H3N2流感病毒共檢出為主。臨床特征顯示，病毒陽性患者的部分臨床癥狀比病毒陰性患者重，更容易出現(xiàn)高熱、咽喉痛、乏力、鼻涕、痰液及呼吸急促等癥狀，且肺部異常多見。不同年齡段患者的感染率存在一定的差異，<5歲患兒最高（50.0%），其次為≥60歲的老年人（38.6%）。 結(jié)論 呼吸道病毒是導(dǎo)致門診患者發(fā)生急性呼吸道感染的常見原因，特別是嬰幼兒和老年人，因此，加強(qiáng)呼吸道病毒的檢測將有助于急性呼吸道感染患者的防治。

[關(guān)鍵詞] 急性呼吸道感染；呼吸道病毒；甲型流感病毒；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

[中圖分類號(hào)] R512.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）18-0116-04

Clinical characteristics and etiologic spectrums of outpatients with acute respiratory infections

LIN Suting1 CHEN Ping2 CUI Dawei3

1.Department of Laboratory Medicine， the Peoples Hospital of Yueqing in Zhejiang Province， Yueqing 325600， China； 2.Department of Laboratory， the First Hospital Affiliated to Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310006， China； 3.Department of Laboratory， the First Affiliated Hospital， College of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310003， China

[Abstract] Objective To analyze clinical characteristics and etiologic spectrums of outpatients with acute respiratory infections（ARIs） for providing basis for clinical treatment of patients. Methods Clinical data and throat specimens of outpatients with ARIs were collected from Jan 2015 to Dec 2016. Their samples were detected for fifteen respiratory viruses by multiple polymerase chain reaction （PCR）， and three subtypes of influenza A virus （FluA） were identified by real-time RT-PCR assay. Results Of 465 outpatients， 137 cases were positive for respiratory viruses， and the total positive rate was 29.5% （137/465）. The percentage of single virus infection was 94.2% （129/137）， and mixed infection was 5.8% （8/137）. FluA virus was most pathogens of single virus infection， followed by enterovirus（EV）. The coinfection with RhV+sH3N2 was major for the mixed infection. Some of clinical symptoms from outpatients with positive viruses were more severe than that of cases with negative viruses， and the outpatients with positive viruses had easily high fever， sore throat， fatigue， nasal discharge， sputum， and shortness of breath and other symptoms， and abnormal lung. The positive rate was significantly different among different ages， the highest of positive rate was children less than five years old（50.0%）， followed by the elderly over the age of 60（38.6%）. Conclusion Respiratory virus is one common cause of outpatients with ARIs， especially young children and the elderly， therefore， the enhancement of respiratory virus detection will contribute to prevention and control of outpatients with ARIs.endprint

[Key words] Acute respiratory infections； Respiratory virus； Influenza A virus； Polymerase chain reaction

呼吸道病毒是引起人類發(fā)生急性呼吸道感染（acute respiratory infections， ARIs）的常見因素，并導(dǎo)致高的發(fā)病率和死亡率，特別是在發(fā)展中國家[1-2]。常見的人呼吸道病毒主要包括：甲型（FluA）和乙型（FluB）流感病毒、鼻病毒（RhV）、呼吸道合胞病毒（RSV-A/B）、腸道病毒（EV）、人腺病毒（ADV）、人副流感病毒（PIV1-4）、人偏肺病毒（hMPV）、人冠狀病毒（CoV-229E/NL63，CoV-OC43/HKU1）和人博卡病毒（BoV）等[3-5]。人甲型流感病毒常見的主要包括3種：季節(jié)性H1N1病毒（sH1N1）、季節(jié)性H3N2病毒（sH3N2）和流行性H1N1（2009）病毒[6]。引起ARIs的呼吸道病毒譜和患者的臨床特征在不同地區(qū)存在一定的差異，因此，監(jiān)測ARIs門診患者的臨床特征和呼吸道病毒譜有助于ARIs患者的預(yù)防和治療。本研究對(duì)2015～2016年浙江省樂清市人民醫(yī)院具有ARIs癥狀的門診患者的臨床特征和呼吸道病毒譜進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年1月～2016年12月在浙江省樂清市人民醫(yī)院發(fā)熱門診就診的465例急性呼吸道感染患者的臨床資料，并采集患者的臨床樣本（咽拭子），且患者就診前均未使用過抗生素。浙江省樂清市人民醫(yī)院是本地區(qū)最大的綜合性醫(yī)院?；颊叩呐R床樣本于-70℃保存待檢。465例患者中，男257例，女208例，年齡6個(gè)月～86歲，平均28.5歲。

1.2 核酸提取

取咽拭子采樣管中200 μL樣本液，應(yīng)用德國QIAGEN公司的病毒核酸提取試劑盒（Rneasy Mini Kit，貨號(hào)：74104）提取病毒核酸，收集終體積為50 μL的病毒核酸RNA洗脫液，并利用NanoDrop ND-2000 核酸分析儀檢測洗脫液的濃度和純度，于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多重PCR檢測呼吸道病毒

首先應(yīng)用大連Takara公司的Prime Script TM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號(hào)：6210A）將病毒核酸RNA合成為cDNA，再利用韓國Seegene公司的多重PCR試劑盒（SeeplexR RV15 ACE Detection Kit，貨號(hào)：RV6F00Y）進(jìn)行擴(kuò)增（試劑盒組成見表1）。PCR擴(kuò)增在BIO-RAD S1000TM Thermal Cycler進(jìn)行，反應(yīng)體系為：3 μL的cDNA，4 μL的5×RV15 ACE引物（A，B，or C），3 μL的8-MOP緩沖稀釋液，10 μL的2×混合反應(yīng)液，總體積為20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94°C 15 min滅活，40循環(huán)（94°C 30 s，60°C 90 s），72°C延伸90 s，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后再應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD GelDocTM XR+ System）對(duì)其進(jìn)行分析。此外，針對(duì)甲型流感病毒陽性的樣本，應(yīng)用早期報(bào)道的單管多重?zé)晒釸T-PCR方法區(qū)分sH1N1、sH3N2和H1N1（2009）三種亞型[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)年齡、臨床特征、性別等資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測情況

465例具有ARIs癥狀的門診患者中，呼吸道病毒的陽性檢出率為29.5%（137/465）。單一病毒感染所占的比例為94.2%（129/137），病毒共檢出所占比例為5.8%（8/137）。在單一病毒感染中，F(xiàn)luA病毒所占比例最高，為55.0%（71/137），其中sH3N2病毒為38株，H1N1（2009）為33株，未檢出sH1N1病毒；其次為EV，共檢出12例，陽性率為9.3%；再次為RhV，檢出率8.5%。病毒共感染中，以兩種病毒共檢出為主，其中RhV+sH3N2為最多，所占比例為50.0%；僅發(fā)現(xiàn)1例感染三種病毒（RhV+sH3N2+CoV-OC43/HKU1）。

2.2 患者的臨床特征

465例門診患者中，病毒檢出率在性別上無顯著差異（χ2=0.579，P=0.447）；病毒陽性的門診患者中：高熱（≥38.0℃）的比例顯著高于病毒陰性的患者，而低熱（37.5℃<發(fā)熱<38℃）的比例顯著低于病毒陰性患者（χ2=18.822，P<0.001）；咽喉痛（χ2=36.187，P<0.001）、乏力（χ2=20.268，P<0.001）、頭痛（χ2=62.7，P<0.001）、呼吸急促（χ2=88.46，P<0.001）、肺部聽診異常（χ2=32.565，P<0.001）及肺部X線/CT表現(xiàn)異常（χ2=20.841，P<0.001）等癥狀的比例均顯著高于病毒陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.3 不同年齡段的病毒分布

不同年齡段的病毒總檢出率存在顯著差異（χ2=31.276，P<0.001），其中<5歲患兒的病毒檢出率最高（50.0%），其次為≥6歲的老年人（38.6%）。單一病毒感染患者中，不同年齡段的病毒檢出率也存在相似的顯著差異（χ2=24.479，P<0.001）。此外，<5歲患兒的病毒共檢出檢出率也最高（4.3%，4/92），且腸道病毒檢出率也最高（8.7%，8/92）（表3）。

3 討論

呼吸道病毒導(dǎo)致的人類發(fā)生ARIs，國內(nèi)外的研究對(duì)象主要關(guān)注住院人群，特別是兒童，而門診患者的相關(guān)研究相對(duì)較少[2-5]。國內(nèi)關(guān)于浙江省樂清地區(qū)關(guān)于急性呼吸道感染門診患者的臨床特征和病毒譜的研究未見報(bào)道。本研究主要關(guān)注于具有ARIs癥狀的門診患者的病毒感染情況，結(jié)果顯示：至少一種呼吸道病毒的陽性檢出率為29.5%，與美國匹茲堡（69%）、我國甘肅?。?7.6%）、山東?。?5.75%）、美國（58%）和上海地區(qū)（32.09%）等國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道存在一定的差異[2-5，7]。這可能與患者的年齡、樣本采集的時(shí)間及季節(jié)、樣本的來源地等因素的不同存在一定的關(guān)系。病毒陽性的患者多數(shù)為單一病毒感染，以FluA病毒為主，而病毒共檢出相對(duì)較少，以RhV+sH3N2為最多，這與早期我國山東省、上海地區(qū)、深圳和巴西、維多利亞等國家和地區(qū)的相關(guān)報(bào)道基本一致[4，5，7-9]。這些研究表明急性呼吸道感染中以單一病毒感染為主，而流感病毒是其主要病原，病毒共檢出相對(duì)較少。我們推測這可能與機(jī)體的抵抗力、感染的季節(jié)和病毒在體內(nèi)的競爭生長等因素有關(guān)。endprint

ARIs引起患者的臨床癥狀主要為發(fā)熱（>37.5°C）伴咳嗽、咽喉痛、呼吸急促和（或）流鼻涕等[2，4]。本研究顯示多數(shù)門診患者以高熱（≥38.0℃）為主（81.3%），且病毒陽性的門診患者發(fā)生高熱的比例顯著高于病毒陰性的患者，這與甘肅省、山東省和黎巴嫩貝魯特地區(qū)等早期的相關(guān)報(bào)道存在一定的差異[4，10]。此外，咽喉痛、乏力、呼吸急促、肺部聽診異常和肺部X線/CT表現(xiàn)異常等參數(shù)與美國匹茲堡和我國山東省等國內(nèi)外的報(bào)道基本一致[2，4，10]。這些臨床癥狀的異同與研究對(duì)象的年齡、感染的季節(jié)、病原的種類和患者的衛(wèi)生環(huán)境等因素可能存在一定的關(guān)系[1， 4，10]。

早期研究表明，兒童和老年人引起免疫力相對(duì)較差，是病毒感染的高危人群[11-15]，而青少年因多數(shù)時(shí)間在學(xué)校學(xué)習(xí)，容易在病毒的流行季節(jié)被感染[1，7，16]。本研究顯示，兒童的病毒感染率顯著高于其他年齡群，其次是老年人，且腸道病毒和病毒共感染在兒童中的比例也相對(duì)較高。表明年齡是影響病毒感染和病毒種類的一個(gè)重要因素，這與我國上海、深圳和巴西、維多利亞等國家和地區(qū)的早期報(bào)道基本一致[7，8，13-15]。

急性呼吸道感染是人類最常見的傳染病之一，較高的發(fā)病率和死亡率給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅，而呼吸道病毒是最常見的因素之一[1-3]。目前，病毒培養(yǎng)雖然是病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，生物安全要求高，且敏感性不高等因素影響，限制了其在臨床上的推廣[6，17]。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)及其衍生的熒光PCR和多重PCR技術(shù)，在病毒診斷上因其快速、敏感、特異等因素的影響，已廣泛應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室研究[17-19]。本研究所選用的試劑盒為國際認(rèn)可的多重PCR試劑盒，敏感性和特異性均較高，且可同時(shí)檢測15種病毒得到廣泛的應(yīng)用[9，20-21]，這使我們檢測的結(jié)果真實(shí)可靠。呼吸道病毒是引起ARIs的重要因素，應(yīng)加強(qiáng)呼吸道病毒的檢測，特別是對(duì)兒童和老年人，為ARIs臨床患者的及時(shí)診斷和治療提供依據(jù)。本研究首次系統(tǒng)性分析了浙江省樂清地區(qū)急性呼吸道感染門診患者的臨床特征和病毒譜，為患者的臨床治療提供科學(xué)的依據(jù)。

本研究僅僅選擇樂清地區(qū)最大的綜合性醫(yī)院，本地區(qū)的其他醫(yī)院因各種原因沒有選入研究單位，且因其樣本量相對(duì)較少和臨床及實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的部分不完善等因素，對(duì)結(jié)果分析存在一定的影響，將在未來的實(shí)驗(yàn)中加大樣本量的采集和選擇本地區(qū)多家醫(yī)院進(jìn)行研究，并逐步完善這些不足。

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（收稿日期：2017-03-28）endprint