羊膜衍生膜負載干細胞通過PI3K/MAPK修復及優(yōu)化軟骨損傷的評估

張治金　曾林如　朱芳兵　郭林　李倩曉

[摘要] 目的 探討人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）負載干細胞通過PI3K/MAPK修復及優(yōu)化軟骨損傷的作用。 方法 新西蘭白兔分離出骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）并與軟骨細胞按4∶1接種于HAAM上，接種后7 d和14 d觀察軟骨細胞的修復及優(yōu)化情況。細胞計數(shù)CCK-8法檢測軟骨細胞的存活率；TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡發(fā)生；Western Blot法檢測軟骨細胞中Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原，磷酸化蛋白p-PKC、p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白表達水平。 結果 與對照組相比，實驗組細胞存活率顯著升高，細胞凋亡顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與對照組相比，實驗組中Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原含量顯著增加；PI3K/MAPK信號通路磷酸化蛋白含量變化明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 羊膜衍生膜負載骨髓間充質干細胞可以修復和優(yōu)化軟骨的損傷，且PI3K/MAPK信號通路在此過程中有重要作用。

[關鍵詞] HAAM；BMSCs；軟骨細胞；PI3K/MAPK

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）18-0031-04

Evaluation of acellular amniotic membrane loaded stem cells in repairing and optimizing cartilage injury by PI3K / MAPK pathway

ZHANG Zhijin1 ZENG Linru1 ZHU Fangbing1 GUO Lin2 LI Qianxiao3

1.Department of Orthopaedics， Xiaoshan District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City， Hangzhou 311201， China； 2.Department of Joint Surgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University， Dalian 116000， China； 3.Department of Cardiology， Hangzhou Red Cross Hospital， Hangzhou 310000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of human acellular amniotic membrane （HAAM） loaded stem cells in repairing and optimizing cartilage injury by PI3K/MAPK pathway. Methods Bone mesenchymal stem cells （BMSCs） were isolated from New Zealand white rabbits and were plated on HAAM combined with chondrocytes at 4：1. The repair and optimization of chondrocytes were observed at 7 and 14 days after inoculation. The survival rate of chondrocytes was detected by cell count CCK-8 method. The apoptosis of chondrocytes was detected by TUNEL method. Western Blot was used to detect the expression of type Ⅰcollagen， type Ⅱ collagen， expression levels of phosphorylated protein p-PKC， p-p38， p-JNK and p-ERK. Results Compared with that in the control group， the survival rate of the experimental group was significantly higher， and cell apoptosis of the experimental group was significantly reduced， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with those in the control group， the typeⅠcollagen and typeⅡcollagen content in the experimental group increased significantly（P<0.05）， and the changes of phosphorylated protein content of PI3K/MAPK signal pathway was significant， the difference was significant（P<0.05）. Conclusion Acellular amniotic membrane loaded bone marrow mesenchymal stem cells can repair and optimize the damage of cartilage， and the PI3K/MAPK signaling pathway plays an important role in this process.

[Key words] HAAM； BMSCs； Chondrocytes； PI3K/MAPK

炎癥、衰老、創(chuàng)傷和其他各種疾病與骨性關節(jié)炎及關節(jié)軟骨損傷的發(fā)生密切相關。抑制軟骨細胞降解，促進軟骨細胞的生長可明顯延緩和優(yōu)化軟骨損傷[1，2]。軟骨細胞是骨性損傷的主要靶細胞，各種生化因素和機械因素作用于軟骨細胞，可刺激軟骨細胞分泌細胞因子、軟骨變性蛋白酶、各種炎性介質，它們可使軟骨變性[3，4]。而骨性關節(jié)軟骨的自我修復能力很差，如何刺激軟骨細胞分泌膠原，改善軟骨損傷是臨床骨科面臨的重要問題之一。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類具有多項分化潛能的細胞，來源豐富容易分離培養(yǎng)，已成為骨組織工程研究中的最佳種子細胞[5]。人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）是一種從細胞滋養(yǎng)層衍化而來的半透明的薄膜，羊膜基底膜上含有多種膠原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等成分，可以促進細胞的增殖分化和組織修復[6-8]。本研究主要利用組織工程技術將骨髓間充質干細胞和軟骨細胞種植于HAAM上，觀察軟骨細胞在HAAM上的生長增殖情況，為修復和優(yōu)化軟骨損傷的進一步研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

一抗多克隆抗體Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原；p-p38、p-JNK、p-ERK、p-PKC、ACTB購于美國SantaCruz生物技術有限公司；二抗堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；Western Blot電泳儀（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及其處理 2只1月齡新西蘭白兔，雌雄不限，BMSCs與軟骨細胞按4∶1接種于HAAM上，調(diào)整總細胞終濃度為5.0×107/mL，隨機分為以下各組：A組為HAAM-BMSCs-軟骨細胞組（其中BMSCs：軟骨細胞=4∶1，實驗組）、B組為BMSCs-軟骨細胞組（其中BMSCs：軟骨細胞=4∶1，對照組）。接種后7 d、14 d觀察軟骨細胞的修復及優(yōu)化情況。

1.2.2 BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定[9] 1月齡實驗兔術區(qū)常規(guī)消毒、鋪巾后行骨穿，用骨髓穿刺針在股骨及脛骨近端進針，連接10 mL注射器，抽取骨髓液4～5 mL，注入含肝素和DMEM/F12的離心管內(nèi)，采用全骨髓貼壁分離篩選法分離、培養(yǎng)BMSCs細胞，制成細胞懸液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，48 h后首次給予全量換液，流式細胞檢測抗原表達，選擇表面抗原CD29、CD90、CD105和CD45進行鑒定，PBS為陰性對照，IgG-PE做為同型對照。

1.2.3 軟骨細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[10] 取上述同一只兔，無菌條件下取雙側膝關節(jié)軟骨，以PBS沖洗3次，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm軟骨塊，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化。用200目不銹鋼無菌濾網(wǎng)過濾，收集細胞，接種到培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，臺盼藍染色細胞活性>95%。取P3軟骨細胞以1×105/mL濃度接種于涂多聚賴氨酸的蓋玻片上培養(yǎng)3 d，4℃丙酮固定30 min，行Ⅱ型膠原免疫組化染色。

1.2.4 羊膜的制備與負載[11] 取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的羊膜并進行相關傳染性檢驗，結果均呈陰性。在超凈臺上清洗并分離羊膜，用含1000 U/mL慶大霉素+25 μg/mL兩性霉素B的生理鹽水浸泡20 min后，用胰蛋白酶于消化30 min，去除雜質細胞。制備成合適大小的羊膜鋪于培養(yǎng)皿中，按比例接種骨髓間充質干細胞和軟骨細胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞存活率 細胞按照對照組與實驗組培養(yǎng)后，取細胞制備成細胞懸液，接種到96孔板中（100 μL/孔），37℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)，隔天換液后加入10 μL CCK8試劑，37℃、5%CO2條件下孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，計算細胞存活率。

1.2.6 TUNEL檢測細胞凋亡 細胞按照對照組與實驗組培養(yǎng)后，取細胞制備成細胞懸液，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明逐步加入生物標記素，在熒光顯微鏡下查找熒光陽性細胞，根據(jù)陽性細胞所占百分率來計算DLBCL細胞的細胞凋亡率。

1.2.7 Western Blot法檢測磷酸化蛋白表達水平 細胞按照對照組與實驗組培養(yǎng)后，收集細胞于冰上裂解2 h，4℃離心后收集蛋白上清液。測定蛋白濃度后，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/μL，加入到10%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉膜后，用牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗4℃過夜。隔天用TBST洗膜3次，并加入二抗孵育1 h。TBST洗膜2次，TBS洗膜1次。用ECL顯色液進行顯色，并對各泳道條帶進行灰度掃描，得出相應的蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件處理，采用單因素方差分析和Bonferroni's Multiple Comparison Test，結果用（x±s）表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞鑒定

應用Beckman counter流式細胞儀分析大鼠間充質干細胞表面標志抗原。如封三圖1所示，培養(yǎng)的第3代細胞已表達 BMSCs細胞表型陽性特征，其CD29、CD90、CD105，陽性率分別為96.72%、98.53%、98.99%；CD45呈陰性，陽性率為0.53%。流式結果表明，收獲的高純度的BMSCs可用于下一步實驗。

2.2 軟骨細胞鑒定

經(jīng)ColⅡ免疫細胞化學染色可見細胞胞漿內(nèi)的ColⅡ染成棕黃色。Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示，收獲的高純度軟骨細胞可用于下一步實驗，見封三圖2。

2.3 CCK-8法檢測細胞存活率

CCK8檢測細胞存活率結果可知，與對照組相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組軟骨細胞存活率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。

2.4 TUNEL檢測細胞凋亡結果

凋亡檢測結果可知，與對照組相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組軟骨細胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖2。

2.5 磷酸化蛋白表達水平

用Western Blot法測得結果可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原、磷酸化蛋白p-PKC和p-ERK蛋白含量的蛋白水平明顯上升，磷酸化蛋白p-p38和p-JNK的蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3。

3 討論

人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）是一種從細胞滋養(yǎng)層衍化而來的半透明的薄膜，羊膜具有抗黏附能力，炎性反應輕，纖維包裹少；同時HAAM抗原性極低，控制排斥反應的發(fā)生，具有良好的生物相容性[12，13]。羊膜基底膜上含有多種膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等成分，這些有效成分增強了其抗拉力，為細胞生長提供了足夠的三維空間結構；為細胞的增殖、分化提供豐富的營養(yǎng)成分，并且有利于種植在羊膜上的細胞粘附和生長[13，14]。羊膜作為一種良好易得的生物材料，易于加工、處理和運輸，為組織工程學的研究提供了便利的條件。研究表明在人羊膜細胞外基質上負載培養(yǎng)的角膜細胞、結膜細胞、成纖維細胞、軟骨細胞等均能良好生長，并保持原本的細胞功能[14，15]。

本研究為了探討羊膜衍生膜負載骨髓間充質干細胞通過PI3K/MAPK信號通路對損傷軟骨的保護作用，研究結果表明隨著培養(yǎng)時間延長，軟骨細胞的存活率逐漸上升，細胞凋亡率逐漸降低，能夠分泌出Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原，說明軟骨細胞在羊膜衍生膜負載骨髓間充質干細胞的條件下可以生長良好，處于良性增殖狀態(tài)。PI3K/MAPK作為兩條經(jīng)典的細胞信號轉導通路，可顯著調(diào)控細胞增殖分化和細胞凋亡等過程[16]。PI3K是一種參與細胞生長及骨架重塑的重要磷脂酰肌醇激酶，也是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，活化后可導致脂質底物磷酸化并激活下游AKT，通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Caspase3、NF-κB、mTOR等，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡與代謝過程[17，18]。同時，在哺乳類細胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三條并行的MAPK信號通路，分別是p38MAPK、JNK/SAPK和ERK信號通路，它們在細胞的生長和分化、細胞的炎性反應及細胞凋亡等應激反應中起重要作用[19-21]。由Western Blot結果可知，磷酸化蛋白p-PKC和p-ERK的蛋白水平明顯上升，磷酸化蛋白p-p38和p-JNK的蛋白水平顯著降低，說明羊膜衍生膜負載骨髓間充質干細胞的條件下可以促進PI3K信號通路的抗凋亡作用，且抑制MAPK信號通路的促凋亡作用，從而調(diào)控細胞增殖與凋亡的發(fā)展過程。

綜上所述，在羊膜衍生膜負載骨髓間充質干細胞的作用可以通過有效調(diào)控PI3K/MAPK信號通路，促進軟骨細胞的發(fā)生發(fā)展過程。進一步了解羊膜衍生膜負載骨髓間充質干細胞對軟骨細胞的修復和活化機制，對治療軟骨損傷和骨關節(jié)疾病等具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2017-03-01）