冰燈玉露離體誘變技術(shù)

周海成+劉艷軍+黃俊軒+楊靜慧+李建科+武春霞

摘 要：為了獲得冰燈玉露新品種，采用冰燈玉露松散型胚性愈傷組織為誘變?cè)嚥?，采用浸泡法和在培養(yǎng)基中加入誘變劑的方法進(jìn)行離體誘變。通過(guò)采用不同濃度EMS和不同處理時(shí)間，找到愈傷組織半致死劑量的EMS使用濃度和時(shí)間，并在此條件下對(duì)冰燈玉露松散型胚性愈傷組織進(jìn)行離體誘變，獲得形態(tài)變化的突變體。結(jié)果顯示，采用在培養(yǎng)基中加入0.1%EMS處理4 d可以獲得理想的半致死效果。以此條件處理冰燈玉露愈傷組織，通過(guò)再生培養(yǎng)可以獲得1.5%的形態(tài)變異的個(gè)體，這些個(gè)體的遺傳變異情況有待進(jìn)一步檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：冰燈玉露；半致死劑量；誘變劑；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.36 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.007

Study on in Vitro Mutagenesis of Haworthia cooperivar

ZHOU Haicheng， LIU Yanjun，HUANG Junxuan，YANG Jinghui，LI Jianke，WU Chunxia

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract：In order to obtain the new variety of Haworthia cooperivar， the embryogenic callus of Haworthia cooperivar was used as mutagenic material. The mutagenesis in vitro was experimented by immersion method and the method by adding mutagen in medium. By using different concentration of EMS and different treatment time， the median lethal dose was found. The embryogenic callus of Haworthia cooperivar was mutated in vitro by this method， and the mutant of morphological change was obtained. The results showed that the ideal median lethal dose could be obtained by adding 0.1% EMS to the medium and treating for 4 days. By this method， after the callus regenerated， 1.5% of the morphological variation individuals were obtained， but the genetic variation of these individuals need to be further tested.

Key words： Haworthia cooperivar； median lethal dose； mutagen； callus

冰燈玉露（Haworthia cooperivar）屬于百合科十二卷屬的多年生肉質(zhì)草本植物，作為玉露中的極品，冰燈玉露的葉片晶瑩剔透，奇特而美麗。近年來(lái)，越來(lái)越受到多肉花卉愛(ài)好者的青睞。雖然一些花卉栽培者收集各種玉露品種，并通過(guò)雜交育種手段培育出一批新的品種，但仍然難以滿足市場(chǎng)的需求[1-3]。近年來(lái)關(guān)于體細(xì)胞誘變育種的研究報(bào)道很多，在許多植物上已經(jīng)得到了應(yīng)用[4-8]。

冰燈玉露在組培方面雖有少量報(bào)道[9-10]，但采用離體誘變技術(shù)進(jìn)行育種的研究很少。本試驗(yàn)以觀賞多肉植物-冰燈玉露為試材，采用體外化學(xué)誘變方法，對(duì)其愈傷組織進(jìn)行誘變處理，尋找誘變的適宜劑量和誘變方法，為冰燈玉露等多肉植物離體誘變育種研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)中采用的試材冰燈玉露松散型胚性愈傷組織為天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 誘變材料的準(zhǔn)備 選取生長(zhǎng)正常的冰燈松散型胚性愈傷組織，在超凈臺(tái)中將其分成直徑為0.5 cm的顆粒。將分割完的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有濾紙與無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，放到25 ℃避光的環(huán)境下培養(yǎng)24 h，目的是消除其培養(yǎng)中激素對(duì)愈傷組織的影響。最后，將處理好的愈傷組織從培養(yǎng)室中取出備用。

1.2.2 采用浸泡法進(jìn)行愈傷組織的離體誘變處理 將EMS用磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH值7.0）配制成不同濃度的溶液，采用抽濾滅菌的方法進(jìn)行消毒處理。在超凈臺(tái)中將滅菌的EMS溶液分別加到100 mL無(wú)菌培養(yǎng)皿中。將事先準(zhǔn)備的愈傷組織加到溶液中，每種濃度分別浸泡1，2，4 h，浸泡時(shí)間到達(dá)后，將愈傷組織從溶液中撈出，用無(wú)菌濾紙吸干EMS溶液后將其接種到事先配制好的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照采用無(wú)菌水處理。愈傷組織培養(yǎng)條件為25 ℃，24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為2 000 lx。經(jīng)過(guò)20 d的培養(yǎng)，對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 采用培養(yǎng)基中添加誘變劑的方法進(jìn)行化學(xué)誘變處理 將滅菌后的MS固體培養(yǎng)基在微波爐中融化，在培養(yǎng)基溫度低于50 ℃時(shí)分別加入一定量的EMS溶液。EMS用磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH值7.0）配制成，采用抽濾滅菌的方法進(jìn)行消毒處理。將含有不同濃度EMS的MS分裝到滅菌的100 mL三角瓶中，每瓶加入30 mL培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，將事先準(zhǔn)備的愈傷組織接種到培養(yǎng)基表面。將接種好的三角瓶放到培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同前一步驟。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定3個(gè)，分別為2，4，8 d。其中每個(gè)三角瓶接種10塊愈傷組織，每個(gè)處理重復(fù)5瓶。對(duì)照接種到MS培養(yǎng)基上。將處理后的愈傷組織再次接種到不添加EMS的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)20 d的培養(yǎng)觀察，記錄統(tǒng)計(jì)愈傷組織的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 采用EMS進(jìn)行冰燈玉露離體誘變 將冰燈玉露松散型胚性愈傷組織按照上一步驟篩選出的最佳誘變劑量及時(shí)間進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)處理后的愈傷組織在MS上進(jìn)行培養(yǎng)。待到球形胚形成時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到MS+0.25 mg·L-1 BA的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)大約2～3次繼代，球形胚即可發(fā)育成為正常的植株。根據(jù)再生植株的生長(zhǎng)情況，可以初步判斷誘變后出現(xiàn)變異的效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡法誘變處理效果

采用浸泡法處理愈傷組織進(jìn)行誘變的操作很簡(jiǎn)單，但在浸泡時(shí)要注意愈傷組織團(tuán)的大小，本試驗(yàn)中采用直徑0.5 cm的大小，但所有愈傷組織為松散型的愈傷組織，因此在操作中很容易將愈傷組織團(tuán)夾碎，所以在轉(zhuǎn)移冰燈玉露愈傷組織時(shí)應(yīng)十分小心。將經(jīng)過(guò)浸泡處理的冰燈玉露愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)室中培養(yǎng)20 d后，愈傷組織出現(xiàn)不同程度的變化，有的在轉(zhuǎn)移的前2 d就出現(xiàn)了死亡，有的一直沒(méi)有變化，具體情況經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)并記錄整理，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，冰燈玉露愈傷組織在經(jīng)過(guò)EMS溶液處理后會(huì)出現(xiàn)不同的變化。首先，在低濃度的EMS處理下或較短的處理時(shí)間后，大部分愈傷組織都可以正常生長(zhǎng)，而且存活下來(lái)的愈傷組織基本都能夠再生；其次，隨著EMS濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織存活率呈現(xiàn)明顯的下降，存活下來(lái)的愈傷組織不能再生，并且當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)30 d，所有存活下來(lái)的愈傷組織褐變死亡。從對(duì)照可以看出，部分愈傷組織在采用無(wú)菌水浸泡后也有少數(shù)死亡的現(xiàn)象，這可能是在轉(zhuǎn)移愈傷組織塊時(shí)，夾碎愈傷組織，導(dǎo)致愈傷組織塊過(guò)小而死亡。由于EMS處理后部分存活下來(lái)的愈傷組織不能再生，因此，確定的半致死劑量失去了實(shí)際意義。本試驗(yàn)曾嘗試采用較低濃度配合較長(zhǎng)處理時(shí)間的方法，仍然不能確定準(zhǔn)確的EMS處理?xiàng)l件，從而實(shí)現(xiàn)部分存活下來(lái)的愈傷組織再生。綜上所述，采用浸泡法很難獲得理想的半致死劑量。

2.2 培養(yǎng)基中添加誘變劑的處理效果

在采用浸泡法不能獲得理想的誘變劑量和處理時(shí)間試驗(yàn)后，本研究又嘗試了在培養(yǎng)基中加入低濃度EMS的方法，在處理一段時(shí)間后，將生長(zhǎng)正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS上，進(jìn)行愈傷組織的再生培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的再生培養(yǎng)后，可以獲得一定數(shù)量的再生苗，具體情況見(jiàn)表2。

從表2的數(shù)據(jù)來(lái)看，EMS的不同濃度和不同處理時(shí)間對(duì)于冰燈玉露愈傷組織的存活率影響差異顯著。首先，在低濃度的EMS或較短的處理時(shí)間的處理組合中，愈傷組織存活率較高，而且存活下來(lái)的愈傷組織都可以再生成苗；其次，隨著EMS處理時(shí)間和處理濃度的增加，愈傷組織的存活率出現(xiàn)大幅度的下降，但再生率相比下降幅度不大。如在采用0.15%EMS處理4 d的試驗(yàn)組合中，愈傷組織的存活率已經(jīng)下降到43%，但愈傷組織的再生率仍然保持88%，這與前一步驟的浸泡法結(jié)果不同。這也說(shuō)明，可以采用這一方法來(lái)確定EMS的處理劑量與處理時(shí)間。因此根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，在采用0.1%EMS濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘變處理4 d可以獲得接近半致死劑量的理想誘變值。

2.3 采用EMS進(jìn)行冰燈玉露離體誘變效果

為了進(jìn)一步證實(shí)采用在培養(yǎng)基中加入誘變劑進(jìn)行冰燈玉露愈傷組織離體誘變的效果，本試驗(yàn)采用在MS培養(yǎng)基中加入0.1%濃度的EMS，將冰燈玉露愈傷組織接種到上面處理4 d，然后將其轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，對(duì)存活下來(lái)的愈傷組織分別進(jìn)行再生培養(yǎng)。通過(guò)觀察這些存活下來(lái)的愈傷組織再生苗的形態(tài)特征，初步判斷采用這一技術(shù)途徑獲得的誘變效率。具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，采用在培養(yǎng)基中加入EMS進(jìn)行冰燈玉露愈傷組織誘變，存活下來(lái)的愈傷組織接近一半，而且這些愈傷組織基本可以再生成苗，這與前面的結(jié)果接近。從產(chǎn)生的表現(xiàn)型變異來(lái)看，變異率大約達(dá)到1.5%，雖然不能準(zhǔn)確判斷這些變異的可靠性，但與對(duì)照相比（對(duì)照在200塊愈傷組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)型異常的）已經(jīng)很高。這說(shuō)明此方法對(duì)于采用愈傷組織為外植體進(jìn)行化學(xué)誘變是可行的。但是，進(jìn)一步判斷變異的可靠性還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

3 結(jié)論與討論

3.1 浸泡法對(duì)于冰燈玉露愈傷組織誘變失敗的原因分析

本研究采用浸泡法進(jìn)行愈傷組織的化學(xué)誘變并不成功，分析其原因可概括為以下幾個(gè)方面。第一，浸泡法一般要采用較高濃度的誘變劑，這樣就會(huì)對(duì)愈傷組織產(chǎn)生較強(qiáng)的破壞作用，如果采用較低的濃度，就會(huì)因?yàn)榻輹r(shí)間過(guò)短而達(dá)不到誘變的效果，因此，對(duì)于有些不容易產(chǎn)生變異的植物品種來(lái)說(shuō)不宜采用此種處理方式。在本試驗(yàn)中冰燈玉露就是不容易發(fā)生突變的植物品種，其品種特性一般不容易改變。第二，冰燈玉露的愈傷組織為松散型胚性愈傷組織，這種愈傷組織細(xì)胞間的間隙較大，容易被誘變劑進(jìn)入，從而使得愈傷組織一直處于誘變劑的作用之下，雖然在試驗(yàn)中采用吸水紙將表面的誘變劑吸掉，但其內(nèi)部還存留較多的誘變劑，從而造成持續(xù)誘變的效果。第三，采用浸泡法的時(shí)間一般不會(huì)很長(zhǎng)，因?yàn)檎T變劑的濃度較高，但較短時(shí)間下，植物細(xì)胞的分裂周期還沒(méi)有完成，一些劣勢(shì)突變很難在去掉誘變劑后繼續(xù)進(jìn)行，細(xì)胞會(huì)因其自我修復(fù)的機(jī)能得以恢復(fù)，因此，產(chǎn)生變異的可能性降低。而采用高濃度誘變劑也會(huì)導(dǎo)致愈傷組織毒害致死，因此，在采用浸泡法進(jìn)行離體誘變時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎采用。第四，浸泡法需要反復(fù)夾取愈傷組織塊，對(duì)愈傷組織產(chǎn)生一定的物理傷害，因此，也會(huì)造成愈傷組織因損傷而死亡的現(xiàn)象，造成此方法的使用障礙。另外，浸泡法由于操作原因，容易污染，處理溫度也需要反復(fù)試驗(yàn)才能準(zhǔn)確采用，這些都增加了誘變的難度，從而導(dǎo)致誘變效果的下降。

3.2 在培養(yǎng)基中加入誘變劑進(jìn)行離體誘變的特點(diǎn)

在培養(yǎng)基中加入誘變劑進(jìn)行植物材料的離體誘變是浸泡法的一種替代，相比之下其主要存在以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。第一，在培養(yǎng)基中加入誘變劑的方法可以采用低濃度誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變，這樣不會(huì)造成對(duì)外植體的毒害作用，因?yàn)槠渥饔脮r(shí)間長(zhǎng)，低濃度誘變劑一樣可以發(fā)揮效率。第二，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)及氧氣充足，愈傷組織外植體在此環(huán)境下不會(huì)產(chǎn)生變化，不會(huì)影響其再生，從而提高誘變效率。第三，采用培養(yǎng)基中加入誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變不會(huì)對(duì)外植體反復(fù)操作，減少了對(duì)愈傷組織破壞和污染的機(jī)會(huì)，從而提高誘變效率。第四，此方法可與篩選壓力共同使用進(jìn)行定向誘變，可以大大提高誘變效率。

雖然，在培養(yǎng)基中加入誘變劑的方法有很多優(yōu)勢(shì)，但也存在一些弱點(diǎn)：首先，誘變劑不能充分作用于整個(gè)外植體，只有接觸培養(yǎng)基的部分作用充分，這樣會(huì)造成非突變體成為主要競(jìng)爭(zhēng)對(duì)象，使得誘變效率下降，這可以通過(guò)在培養(yǎng)基中加入篩選壓力進(jìn)行定向誘變加以解決；其次，誘變劑在加入培養(yǎng)基中會(huì)受到培養(yǎng)基中化學(xué)成分的影響從而降低誘變效果；另外，在加入培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的溫度對(duì)誘變劑也產(chǎn)生不利影響。總之，采用何種誘變方法應(yīng)根據(jù)誘變材料和誘變目標(biāo)的不同做出選擇，并進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

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