人IL-29定點(diǎn)突變體抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分析

李利云， 陸 源， 葛春蕾， 彭榮剛，李昕哲，譚 敬， 陳永康，陳 偉*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

人IL-29定點(diǎn)突變體抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分析

李利云1， 陸 源2， 葛春蕾1， 彭榮剛3，李昕哲3，譚 敬3， 陳永康3，陳 偉*3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為分析人白細(xì)胞介素-29（hIL-29）變異體抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，采用大引物PCR方法對(duì)人hIL-29基因第104位堿基進(jìn)行點(diǎn)突變，使hIL-29肽鏈第35位Arg定點(diǎn)改造為L(zhǎng)ys。得到的hIL-29變異體基因經(jīng)重組后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115和誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化獲得重組蛋白rhIL-29mut35。SDS-PAGE分析顯示rhIL-29mut35的相對(duì)分子質(zhì)量約23×103，Western Blotting鑒定顯示其與羊抗人IL-29多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用CCK-8試劑檢測(cè)rhIL-29mut35對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，rhIL-29mut35在不同質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞BEL7402、肺腺癌細(xì)胞A549和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的增殖均有抑制作用，高劑量組（1 000 ng/mL）rhIL-29mut35對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞BEL7402、肺腺癌細(xì)胞A549和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8增值的抑制率分別為（34.20±1.50）%、（27.30±0.31）%、（30.20±0.68）%、（29.13±1.40）%，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而且高劑量組的抗增殖效應(yīng)高于野生型rhIL-29的（P＜0.01），這為進(jìn)一步研制開發(fā)IL-29的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

人白細(xì)胞介素-29；定點(diǎn)突變；重組蛋白；抗腫瘤活性

Kotenko等[1]和Sheppard等[2]兩個(gè)研究小組于2003年共同發(fā)現(xiàn)Ⅲ型干擾素，它包括3個(gè)成員：IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，即IL-29、IL-28A和IL-28B。IL-29通過結(jié)合異源二聚體受體復(fù)合物IFN-λR1和 IL-10R2激 活 JAK-STAT（Janus kinase-signal transducer of transcription）信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮其生物學(xué)活性[1-2]。IL-29與Ⅰ型干擾素具有相似的生物學(xué)性質(zhì)，如抗病毒、抗腫瘤、抗增殖以及免疫調(diào)節(jié)等效應(yīng)[3-5]。Miknis等[6]研究發(fā)現(xiàn)，IL-29肽鏈的某些氨基酸的改變可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其與受體結(jié)合的親和力，從而影響其生物學(xué)活性。

文中作者根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果[7]，采用大引物PCR方法對(duì)人白細(xì)胞介素-29（hIL-29）基因的104位堿基進(jìn)行突變，使hIL-29第35位Arg定點(diǎn)改造為L(zhǎng)ys，期望提高其抗腫瘤活性，從而為深入研究探討IL-29抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌株、質(zhì)粒 人肺腺癌細(xì)胞A549由邱麗穎教授（江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院）惠贈(zèng)；人胃癌細(xì)胞SGC7901、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8和人肝癌細(xì)胞BEL7402由金堅(jiān)教授 （江南大學(xué)藥學(xué)院）惠贈(zèng)；E.coli JM109，畢赤酵母（Pichapastoris）GS115由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆質(zhì)粒pUCm-T，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司（簡(jiǎn)稱上海生工）；真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM，購(gòu)自Invitrogen公司并經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造和保存；重組質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29（整合了hIL-29全長(zhǎng)DNA的pPIC9KM質(zhì)粒）由本研究室構(gòu)建并保存[8]，用于表達(dá)帶有天然N端的hIL-29。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ和SalⅠ，T4 DNA連接酶及 250 bp DNA Ladder Marker，低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)于大連Takara公司；Taq plus DNA聚合酶、硝酸纖維素膜（NC膜）、HRP標(biāo)記兔抗羊IgG、EZ-10柱式DNA回收試劑盒，均購(gòu)自上海生工；普通新生牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；羊抗人IL-29多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó) R&D公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；干擾素α2b標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自北京凱因科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8試劑和胰酶細(xì)胞消化液，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 以hIL-29基因序列為模板，通過Oligo7軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼hIL-29成熟肽cDNA的特異性上游引物（命名為hIL-29-F）、下游引物 （命名為hIL-29-R）及突變引物 （命名為Mutant Primer）。突變引物中第16位堿基設(shè)計(jì)為T，使該堿基組成的密碼子由AGG突變?yōu)锳AG，該密碼子編碼的氨基酸則由Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys。引物序列見表1，引物由上海生工合成。

表1 用于大引物PCR的引物序列Table 1 O ligonucleotides used for megaprimer PCR

1.2 方法

1.2.1 rhIL-29mut35基因的克隆與鑒定 利用大引物PCR方法對(duì)hIL-29基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。大引物PCR包括兩輪PCR擴(kuò)增，兩輪PCR擴(kuò)增都以pPIC9KM-hIL-29質(zhì)粒為模板。第一輪PCR擴(kuò)增以hIL-29-F和Mutant Primer為引物，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸60 s，2個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，28個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，10℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，按DNA回收試劑盒說明書回收目的片段。以第一輪PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物和hIL-29-R為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同第一輪PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠成像儀拍照并按DNA回收試劑盒說明書回收目的基因片段。

1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-rhIL-29mut35的構(gòu)建 回收的目的基因片段與pUCm-T連接，化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布于預(yù)先涂有IPTG和X-gal的氨芐抗性瓊脂平板上，放置1 h后，倒置培養(yǎng)過夜。藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，條帶大小正確的菌株送上海生工測(cè)序（命名為JM109/pUCm-T-hIL-29mut35）。將測(cè)序正確的pUCm-T-rhIL-29mut35及pPIC9KM質(zhì)粒雙酶切然后割膠回收并連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR條帶大小正確的菌株送上海生工測(cè)序（命名為JM109/pPIC9KM-hIL-29mut35）。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPIC9KM-rhIL-29mut35的表達(dá)及鑒定測(cè)序正確用堿裂解法抽提重組質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29mut35并用 SalⅠ線性化， 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于組氨酸缺陷型的MD平板。G418篩選高拷貝重組菌株。經(jīng)菌液PCR鑒定正確的進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵條件按照參考文獻(xiàn)[9]。發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE（12 g/dL分離膠，5 g/dL濃縮膠）鑒定。

1.2.4 重組蛋白 rhIL-29mut35的純化及活性分析將發(fā)酵液離心收集上清液，經(jīng)過硫酸銨沉淀初步除去色素和部分雜蛋白質(zhì)。用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（10 mmol/L，pH 6.0）將沉淀復(fù)溶，然后經(jīng)透析除去部分鹽離子；最后經(jīng)SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析進(jìn)一步純化重組蛋白。陽離子交換層析具體步驟按參考文獻(xiàn)[10]。SDS-PAGE分析各洗脫峰，將含有rhIL-29mut35的洗脫液冷凍干燥。取凍干粉末用PBS（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）稀釋，Western blotting分析鑒定rhIL-29mut35的活性，具體步驟按參考文獻(xiàn)[8-9]。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)rhIL-29mut35抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng) 腫瘤細(xì)胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8細(xì)胞用改良型RPMI1640完全培養(yǎng)基 （含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清，簡(jiǎn)稱1640完全培養(yǎng)基）在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)和傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化后，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL；按每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞貼壁情況，確認(rèn)貼壁且生長(zhǎng)良好后吸去上清液；每孔分別加入100μL用1640完全培養(yǎng)基稀釋的陽性對(duì)照 IFN-α2b、野生型rhIL-29、rhIL-29mut35，每個(gè)樣品設(shè)置50、500 ng/mL和1 000 ng/mL 3個(gè)劑量組，每組設(shè)5個(gè)平行孔；空白（不接種細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（接種細(xì)胞）加入等體積的1640完全培養(yǎng)基，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，每孔加入 10μL Cell Counting Kit-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)30～60 min（不同細(xì)胞測(cè)板時(shí)間不同）后用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（OD450），按式（1）計(jì)算各組樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率。

其中，OD450陰性為陰性對(duì)照組OD450值；OD450樣品為樣品組OD450值；OD450空白為空白組OD450值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析各組樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 大引物PCR產(chǎn)物分析鑒定

通過大引物PCR，第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約130 bp的特異性條帶，大小與理論值相符（見圖1泳道1）；第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析，在約560 bp可見特異性條帶，且與理論值相符（見圖1泳道2）。

2.2 重組質(zhì)粒測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果

陽性轉(zhuǎn)化子JM109/pUCm-T-hIL-29mut35的測(cè)序結(jié)果顯示其大小為546 bp，編碼181個(gè)氨基酸；將測(cè)定的序列與Gene Bank的hIL-29基因序列（登錄號(hào)：AY336716.1）比對(duì)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒JM109/ pUCm-T-hIL-29mut35中目的基因第104位堿基G成功突變?yōu)锳，且其余序列完全一致（見圖2）。重組真核表達(dá)質(zhì)粒JM109/pPIC9KM-hIL-29mut35的測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，JM109/pPIC9KM-rhIL-29mut35中目的基因與JM109/pUCm-T-rhIL-29mut35中的完全一致。

圖1 大引物PCR結(jié)果Fig.1 Result ofmegaprimer PCR

2.3 重組質(zhì)粒pPIC9KM-rh IL-29mut35在P.pastoris GS115中的表達(dá)及鑒定

用3’-AOX和5’-AOX通用引物進(jìn)行酵母菌液PCR擴(kuò)增，以空酵母GS115的基因組為模板作對(duì)照，擴(kuò)增出約2 200 bp和500 bp的DNA條帶；而以 GS115/pPIC9KM-hIL-29mut35重組子為模板，PCR擴(kuò)增出約2 200 bp和1 000 bp的特異性條帶（見圖3），表明hIL-29mut35基因已成功整合入宿主基因組中。鑒定正確的重組子按參考文獻(xiàn)[8]條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE（12 g/dL分離膠，5 g/dL濃縮膠）鑒定。在約23 000處可見目的蛋白質(zhì)條帶，與理論值相符（見圖4）。

圖2 h IL-29和rh IL-29mut35的序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence comparison result of h IL-29 and rh IL-29mut35

圖3 GS115/pPIC9KM-rh IL-29mut35的菌液PCR鑒定Fig.3 PCR confirmation of GS115/pPIC9KM-rh IL-29mut35

圖 4 GS115/pPIC9KM-h IL-29mut35重組子發(fā)酵液上清的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed supernatant of recombinant GS115/pPIC9KM-h IL-29mut35

2.4 rh IL-29mut35的純化及活性分析

發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析后，再經(jīng)SPSepharose Fast Flow交換層析洗脫收集洗脫液，用SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，rhIL-29mut35主要出現(xiàn)在含0.6mol/LNaCl的液洗脫峰（峰4），其余洗脫峰為雜蛋白質(zhì)（見圖5）。

圖5 rh IL-29mut35的SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析Fig.5 SP-Sepharose Fast Flow cation exchange column of rh IL-29mut35

取純化的 rhIL-29mut35及未純化發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析結(jié)果顯示，純化的rhIL-29mut35在SDS-PAGE及Western blotting圖譜上均出現(xiàn)單一條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量大小約23 000（見圖6—7），表明純化的rhIL-29mut35可與羊抗人IL-29抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，保持了免疫學(xué)活性，可用于體外細(xì)胞學(xué)活性的檢測(cè)。

圖6 rh IL-29mut35的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of rh IL-29mut35

圖7 rh IL-29mut35的W estern blotting鑒定Fig.7 Western blot analysis of rh IL-29mut35

2.5 rh IL-29mut35的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性

按1.2.5方法檢測(cè)rhIL-29mut35對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)顯示，不同劑量組的rhIL-29mut35對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞BEL7402、肺腺癌細(xì)胞A549和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的增殖均表現(xiàn)出抑制作用（見表2）；尤其高劑量組對(duì)4株腫瘤細(xì)胞的增殖均具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，與陰性對(duì)照組相比，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同質(zhì)量濃度rhIL-29mut35對(duì)腫瘤 細(xì)胞 SGC7901、BEL7402、A549和HCT8的抑制率的P值見表3。

表2 rh IL-29mut35對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8的抑制率Table 2 Inhibition ratios of tumor cells SGC7901，BEL7402，A549 and HCT8 by rh IL-29mut35

表3 rh IL-29mut35對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8的抑制率的P值Table 3 P values of inhibition ratios of tumor cells SGC7901，BEL7402，A549 and HCT8 by rh IL-29mut35

方差分析結(jié)果顯示，rhIL-29mut35、IFN-α2b及野生型rhIL-29對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8增殖的抑制各有差異。對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901，高劑量組rhIL-29mut35的抑制效應(yīng)高于IFN-α2b及rhIL-29的（見圖8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 rh IL-29mut35對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的抗增殖效應(yīng)Fig.8 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the gastric cancer cell SGC7901

對(duì)肝癌細(xì)胞BEL7402，中劑量組rhIL-29mut35的抑制效應(yīng)顯著高于IFN-α2b及rhIL-29的，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而3個(gè)樣品高劑量組對(duì)BEL7402細(xì)胞的增值抑制效應(yīng)差異不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖9）。

圖9 rh IL-29mut35對(duì)肝癌細(xì)胞BEL7402的抗增殖效應(yīng)Fig.9 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the liver cancer cell BEL7402

對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549，高、中和低劑量組rhIL-29mut35的抑制效應(yīng)均大于野生型rhIL-29及 IFN-α2b的，其中高劑量組的效應(yīng)顯著高于IFN-α2b及野生型rhIL-29，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明rhIL-29mut35對(duì)A549的增殖抑制效應(yīng)較強(qiáng) （見圖10）。

圖10 rh IL-29mut35對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的抗增殖效應(yīng)Fig.10 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the lung adenocarcinoma cell A549

對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8，高、中和低劑量組rhIL-29mut35的抑制效應(yīng)均大于野生型 rhIL-29及IFN-α2b的，尤其高、中劑量組的效應(yīng)顯著高于野生型rhIL-29及IFN-α2b，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），表明rhIL-29mut35對(duì)HCT8的增殖抑制作用較強(qiáng)（見圖11）。

圖11 rh IL-29mut35對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的抗增殖效應(yīng)Fig.11 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the colon cancer cell HCT8

3 結(jié)語

文中作者采用定點(diǎn)突變方法對(duì)hIL-29肽鏈進(jìn)行分子改造后，得到的變異體rhIL-29mut35蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞BEL7402、肺腺癌細(xì)胞A549和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的增殖抑制作用均高于野生型rhIL-29，表明對(duì)hIL-29與受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)改造可望提高其抗增殖作用。rhIL-29mut35對(duì)4種腫瘤細(xì)胞增殖表現(xiàn)出不同的抑制效應(yīng)，可能是因不同腫瘤細(xì)胞的IL-29受體表達(dá)存在差異[11]。Li等[12]研究表明，IL-29可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞分裂而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸與IL-29抗腫瘤細(xì)胞增殖的構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理還需深入研究，從而為研制開發(fā)IL-29的抗腫瘤藥物奠定免疫藥理基礎(chǔ)。

[1]KOTENKO S V，GALLAGHER G，BAURIN V V，et al.IFN-lambdasmediate antiviral protectionthrough a distinct classⅡcytokine receptor complex[J].Nat Immunol，2003，4（1）：69-77.

[2]SHEPPARD P，KINDSVOGELW，XUW F，etal.IL-28，IL-29 and their classⅡcytokine receptor IL-28R[J].Nat Immunol，2003，4（1）：63-68.

[3]GUENTERBERG K D，GRIGNOL V P，RAIG E T，et al.Interleukin-29 binds to melanoma cells inducing Jak-STAT signaltransduction and apoptosis[J].Mol Cancer Ther，2010，9（2）：510-520.

[4]MAHER S G，SHEIKH F，SCARZELLO A J，et al.IFN-αand IFN-λdiffer in their antiproliferative effects and duration of JAK/STAT signaling activity[J].Cancer Biol Ther，2008，7（7）：1109-1115.

[5]MEAGER A，VISVALINGAM K，DILGER P，et al.Biological activity of interleukins-28and-29：comparison w ith typeⅠinterferons[J].Cytokine，2005，31（2）：109-118.

[6]M IKNISZ J，MAGRACHEVA E，LIW，etal.Crystalstructure of human interferon-λ1 in complex w ith its high-affinity receptor interferon-λR1[J].JM olBiol，2010，404（4）：650-664.

[7]ZHENG Haijun，ZHU Rong，GEChunlei，etal.Bioinformaticsofhuman interleukin-29[J].Chin J Biologicals M arch，2013，26（2）：209-212.（in Chinese）

[8]CHEN Wei，YU M inglei，ZHENG Haijun，et al.Cloning and eukaryotic expression of human interleukin-29 gene[J].Chin J BiologicalsMarch，2012，25（4）：446-448.（in Chinese）

[9]ZHENG Haijun，LU Yuan，CHEN Wei，et al.Optimization of condition for expression of native N-term inus of human interleukin-29mature peptide in Pichia pastoris[J].Chin JBiologicals M arch，2013，26（3）：402-405.（in Chinese）

[10]LU Yuan，CHENWei，LILiyun，etal.Expression of recombinanthuman interleukin-29mutant in Pichia pastoris and antitumor analysis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2016，35（2）：185-191.（in Chinese）

[11]WITTE K，WITTE E，SABAT R，etal.IL-28A，IL-28B，and IL-29：prom ising cytokinesw ith type I interferon-like properites[J]. Cytokines Grow th Factor Rev，2010，21（4）：237-251.

[12]LIQ，KAWAMURA K，MA G，etal.Interferon-lambda induces G1 phase arrestor apoptosis in oesophageal carcinoma cells and producesanti-tumoureffects in combinationw ith anti-canceragents[J].Eur JCancer，2010，46（1）：180-190.

Anti-Tumor Proliferation Activity of h IL-29 Variant

LILiyun1， LU Yuan2， GE Chunlei1， PENG Ronggang3， LIXinzhe3，
TAN Jing3， CHEN Yongkang3， CHENWei*3
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

In order to analyze the antineoplastic activity of human interleukin-29（hIL-29）variant，a mutant gene of hIL-29 was amplified bymegaprimer PCR，and the Arg35 of hIL-29 peptide chain wasmutated to Lys35.A recombinantplasmid was constructed and transformed into Pichia pastoris GS115，the recombinantprotein rhIL-29mut35was induced and purified.The purified rhIL-29mut35had a relativemolecularmass of about 23×103on SDS-PAGE profile and showed specific reaction w ithgoat anti-human IL-29 polyclonal antibody in Western blotting.W ith the Cell Counting Kit-8 reagent，the rhIL-29mut35was found to has anti-proliferation effect on tumor cells SGC7901，BEL7402，A549 and HCT8 separately w ith inhibition ratios of（34.20±1.50）%，（27.30±0.31）%，（30.20±0.68）%and （29.13±1.40）% in the high dose group.The anti-proliferation effect of rhIL-29mut35wasstronger than thatofw ild type rhIL-29（P＜0.01），which supported the developmentof antineoplastic drugsof IL-29.

human interleukin-29，site-directedmutation，recombinantprotein，antineoplastic activity

Q 71

A

1673—1689（2017）05—0553—07

2015-05-04

*通信作者：陳 偉（1956—），男，江西宜豐人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)和生物制藥方面的研究。

E-mail：chenwei@jiangnan.edu.cn

李利云，陸源，葛春蕾，等.人IL-29定點(diǎn)突變體抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（05）：553-559.