超高壓對解脂耶氏酵母脂肪酶酶活的影響

楊新穎，陳 剛， 杜煥梅，繆 銘， 馮 骉*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

超高壓對解脂耶氏酵母脂肪酶酶活的影響

楊新穎1，陳 剛1， 杜煥梅2，繆 銘2， 馮 骉*1

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

研究了超高壓體系中，壓力、溫度、pH和保壓時間對解脂耶氏酵母脂肪酶活性的影響。結果表明：在超高壓作用下，解脂耶氏酵母脂肪酶的活性有所提高；經(jīng)正交試驗優(yōu)化得到在壓力450 MPa、溫度45℃、pH 7.5、保壓時間10 min條件下，脂肪酶活性最高，為同等條件下常壓處理的脂肪酶活性的220%。經(jīng)高壓處理后，脂肪酶的最適pH較常壓條件下向堿性方向移動0.5。

超高壓；脂肪酶；活性

超高壓技術即高靜水壓技術 （high hydrostatic pressure，HHP），是一種新型的食品非熱加工技術[1]。一般認為壓力超過100 MPa就是超高壓，而在實際應用中通常用到的超高壓處理范圍為100～1 000 MPa。近年來，超高壓在食品中的應用日益受到關注，有關超高壓下酶活性變化的研究也越來越多。起初超高壓技術的應用主要著眼于殺菌鈍酶，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)超高壓也可以提高酶的活性[2]。不同酶類在經(jīng)超高壓處理后，在活性方面表現(xiàn)不同。有些酶類在經(jīng)超高壓處理后，其活性起初會增強，隨著壓力的升高又逐漸減弱。超高壓加工主要引起酶蛋白的二、三、四級結構變化[3]，其變性機制與熱變性和化學變性劑的變性機制不同。部分蛋白質分子在經(jīng)超高壓處理后不會發(fā)生變化，而且水溶液中的共價鍵也不會受到影響[4]。

作為一種應用廣泛的酶，脂肪酶受到越來越多的關注，而關注的熱點主要是其活性和穩(wěn)定性的變化。在超高壓應用于脂肪酶方面，Eisenmenger等[5]研究得到C.antarctica脂肪酶（Sigma-Aldrich）在低壓下酶活增加110%，而在高壓350 MPa下酶活增加了239%。Noel等[6]研究發(fā)現(xiàn)超高壓可以提高 R. miehei（FLUCA）脂肪酶活性。常壓下，此酶在50℃和55℃放置一段時間，相對殘余酶活均低至5%，而在高壓下（50～350MPa）放置相同時間，相對殘余酶活可至少分別保持在60%和20%。但目前，有關超高壓處理脂肪酶及對其活性影響的研究還較少，因此本研究中以解脂耶氏酵母脂肪酶為研究對象，以酶活性的變化來分析超高壓體系下，壓力、溫度、pH和保壓時間對脂肪酶活性的影響，為超高壓加工技術在激發(fā)酶活性方面的研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料 解脂耶氏酵母脂肪酶，由北京市生物加工過程重點實驗室贈送；橄欖油，酚酞，磷酸二氫鉀，二水合磷酸二氫鈉，十二水合磷酸氫二鈉，聚乙烯醇，氫氧化鈉，95%乙醇，分析純，國藥集團上?；瘜W試劑公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗設備 S-FL-085-09-W型超高壓儀器，英國Stansted Fluid Power公司產(chǎn)品；Allegra 25R型臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼公司產(chǎn)品；99-1A型磁力攪拌器，金壇榮華儀器有限公司產(chǎn)品；高速勻漿機，德國 IKA公司產(chǎn)品；EL20K型酸度計，EL104型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司產(chǎn)品；DKB-501A型超級恒溫水浴，上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪酶水解活力檢測 見GB/T 23535—2009指示劑滴定法[7]。

脂肪酶活性以脂肪酶活性單位表示，定義為在一定溫度和 pH條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol的可滴定脂肪酸所需要的酶量，即為1個酶活單位。相對殘余酶活定義為高壓處理后的脂肪酶活性/對照組脂肪酶活性，對照組為pH 7.5、40℃、常壓下處理10 min的脂肪酶。

1.2.2 高壓下不同因素對脂肪酶活性的影響 稱取脂肪酶0.15 g，溶于10mL 0.25mol/L的一定pH（6.0～8.5）的磷酸緩沖液，混勻。8 000 r/min（4℃）高速離心20min，然后取上清液于100mL的容量瓶定容，在特定壓力（0.1～600 MPa）、特定溫度（40～60℃）下處理一段時間（5～50min），取出后立即測其活性。

1.2.3 脂肪酶的復原性分析 將處理后的脂肪酶于4℃下靜置一定時間（0～2 h），分別于不同時間取出檢測其活性。

1.2.4 正交試驗 根據(jù)前期試驗結果，選取L9（33）正交表進行試驗。

2 結果與討論

2.1 壓力對脂肪酶活性的影響

選取脂肪酶的最佳作用溫度40℃，最佳作用pH 7.5，在溫度40℃、pH 7.5時，分別在 0.1～600 MPa處理10min后，相對殘余酶活如圖1所示。

圖1 壓力對Y.lipolytica脂肪酶活性的影響Fig.1 Effectofpressureon theactivity of Y.lipolytica lipase

當壓力低于500 MPa時脂肪酶活性均比0.1 MPa（未經(jīng)高壓處理）的脂肪酶活性高，在100～450MPa壓力范圍內(nèi)，相對殘余酶活隨壓力的增加而增大，當壓力為450 MPa時酶活達到最大值，為常壓下脂肪酶活性的209%；當壓力超過450 MPa后，相對殘余酶活開始降低，600 MPa時，相對殘余酶活大大低于0.1 MPa下酶活。前人的研究指出，某些脂肪酶在高壓作用下，維持活性中心的非共價鍵發(fā)生變化，導致酶活性增高。但同時高壓對蛋白質也有鈍化作用。因此，當壓力達到一定值后，酶活性將下降。不同來源的脂肪酶活性提高的幅度不同，活性最高時對應的壓力值也不相同。通過實驗發(fā)現(xiàn)，當壓力超過某個特定值時（在特定時間內(nèi)）酶的活性會迅速下降直到完全失活，這個特定壓力值被稱為最低失活壓力。本實驗中脂肪酶的最低失活壓力在550MPa左右。本實驗中的趨勢與前人[8]的研究結果一致，但最高活性對應的壓力值比較高，說明該脂肪酶具有較好的抗壓穩(wěn)定性。

2.2 高壓下溫度對脂肪酶活性的影響

在0.1 MPa和450 MPa下（pH7.5），分別在不同溫度（40～60℃）處理10 min，結果如圖2所示?？梢钥闯觯合?，酶的活性在溫度高于40℃后由于蛋白質的熱變性而急劇下降；而高壓處理增加了酶的穩(wěn)定性，以至于溫度達到45℃時酶的活性達最高值，相對殘余酶活為220%。45℃以后高壓下酶的活性迅速下降，但仍比同等條件常壓下的酶酶活高。由此可知，脂肪酶不耐高溫，高溫下活性很低。這是因為脂肪酶的空間構象由于高溫發(fā)生了變化，從而導致部分失活。非共價鍵是維持酶活性中心結構的主要因素，外來能量的供給影響非共價鍵的化學解離，溫度越高，越有可能使非共價鍵發(fā)生解離[9]。而在超高壓體系中，壓力誘導的酶的穩(wěn)定與熱失活拮抗，因為壓力會改變酶活性中心周圍的構象，使酶的空間結構得到保護，從而使得酶的耐熱能力提高。用Sun等[10]的觀點解釋就是，在分子層面上，壓力和熱是拮抗的。從實驗結果來看，高壓對于高溫引起的熱變性具有顯著的拮抗作用。

圖2 溫度對Y.lipolytica脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of Y.lipolytica lipase

2.3 高壓下pH對脂肪酶活性的影響

將溶于不同pH緩沖液的脂肪酶置于40℃條件下，分別在0.1MPa和450 MPa下處理 10min，研究高壓處理前后pH與脂肪酶活性的關系，結果如圖3所示?？芍?，0.1MPa下，脂肪酶的最適pH為7.0，并且相對殘余酶活隨著pH的增加先上升后下降。而經(jīng)高壓處理后，隨著pH的增加，酶活的變化趨勢與常壓下一致，但pH 7.5時，脂肪酶的活性最高。pH 6.0～7.0時，常壓與450 MPa處理的脂肪酶酶活基本相同。脂肪酶經(jīng)高壓處理后，最適pH值向堿性方向移動0.5，且在堿性條件下有更好的耐受性。這一結果受到不同因素的影響。首先，體系的pH經(jīng)過高壓處理會發(fā)生變化。Heremans[4]等曾經(jīng)通過實驗發(fā)現(xiàn)隨著壓力的升高，蘋果汁的pH會降低，且壓力相差500 MPa，pH便可相差近1個單位；其次，則是酶本身的特殊性，其化學本質是蛋白質，是一種兩性物質，所以酶分子的解離狀態(tài)可能受到壓力的影響而發(fā)生改變，影響酶的活性。

圖3 高壓下pH對Y.lipolytica脂肪酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of Y.lipolytica lipase

2.4 保壓時間對脂肪酶活性的影響

將溶于pH7.5磷酸鹽緩沖液的脂肪酶置于40℃條件下，分別在0.1MPa和450MPa下處理不同時間，測得脂肪酶活性的變化，得到圖4。

圖4 保壓時間對Y.lipolytica脂肪酶活性的影響Fig.4 Effect of dwell time on the activity of Y.lipolytica lipase

由圖4可知，常壓下，酶活性隨著保壓時間的延長逐漸降低，經(jīng)高壓處理的脂肪酶酶活先上升后下降，在10min時達到最大值，但任何保壓時間下，經(jīng)450 MPa加壓處理的脂肪酶活性都比常壓下的脂肪酶活性高，說明加壓可以抵抗脂肪酶的熱變性。在壓力一定的時候，脂肪酶的激活或酶結構的破壞與保壓時間密切相關。勵建榮等[11]曾經(jīng)提出過，隨著保壓時間的增長酶的活性通常會降低。

2.5 高壓處理后的脂肪酶的復原性分析

高壓處理脂肪酶的復原性分析如圖5所示。常壓下處理的脂肪酶活性沒有反彈或者波動，比較穩(wěn)定。高壓處理的脂肪酶活性先降低后趨于穩(wěn)定，相對殘余酶活降低20%左右。實驗中，16 h后對其酶活進行檢測，仍保持穩(wěn)定。表明高壓解除后，脂肪酶構象部分恢復。因為適當?shù)膲毫Ψ秶⒉粫γ傅慕Y構造成破壞性的影響，只是對結構有擠壓作用，當壓力釋放并靜置于常壓下時，這些被擠壓的結構就會緩慢的復原，所以就出現(xiàn)了酶的復原性。張瑜[12]等的研究結果顯示某脂肪酶（諾維信公司）在常壓下處理后，其活性未發(fā)生反彈，高壓處理后活性在48 h后均有所增加。尹曼等[13]研究發(fā)現(xiàn)，150MPa和200MPa下，隨著貯存時間的增長皺褶假絲酵母脂肪酶的活性先升高后下降，最終處于鈍化狀態(tài)；在貯存1 h后，活性達到最高。通過對這些實驗結果的比較分析可以得知，壓力釋放后，靜置在常壓下，酶蛋白結構的恢復有可能使酶活提高也有可能使酶活降低，不同的酶會有不同的反應。

圖5 高壓處理后的脂肪酶的復原性分析Fig.5 Resilience of lipase activity after HHP treatment

2.6 正交試驗

根據(jù)前期試驗結果，綜合考慮選取壓力、溫度、時間三個因素設計正交試驗，選取L9（33）正交表，具體方案和結果見表1—2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design

表2 正交試驗方案和結果Table 2 Design scheme and results of the orthogonal experiment

結果表明，在選取因素的數(shù)值范圍內(nèi)，溫度對脂肪酶活性的影響最大，其次是反應時間，壓力大小影響最小。結合前面實驗結果得到脂肪酶活性最高的條件為：450 MPa，45℃，反應時間10min。在最優(yōu)條件下，脂肪酶的相對殘余酶活達到220%。

3 結語

在高壓體系中，壓力、溫度、保壓時間和pH等因素與脂肪酶的活性密切相關。在壓力450 MPa、溫度45℃、pH 7.5、保壓時間10 min條件下，脂肪酶活性為同等條件下常壓處理的脂肪酶的220%。常壓下，酶的活性在溫度高于40℃后由于蛋白質的熱變性而急劇下降；而高壓處理增加了酶的穩(wěn)定性，以至于溫度達到45℃時酶的活性達最高值，酶活提高了100%以上。高壓處理的脂肪酶，pH 7.5時的活性最高，與常壓處理的脂肪酶相比最適pH向堿性移動0.5。隨著保壓時間的延長，經(jīng)高壓處理的脂肪酶酶活先上升后下降，保壓時間為10 min時，脂肪酶活性最高。高壓處理后，隨著貯藏時間的延長酶活會先下降，之后保持穩(wěn)定；高壓解除后，脂肪酶構象部分恢復。

參考文獻：

[1]MOAZHAEV V V，HEREMANS K，F(xiàn)RANK J，et al.Exploiting the effects of high hydrostatic pressure in biotechnological applications[J].Trends in Biotechnology，1994，12（12）：493-501.

[2]JIANG Bo，M IAO M ing.Catalytic system of food enzyme under hydrostatic high pressure：status and trends[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2011，11（9）：93-97.（in Chinese）

[3]KNORR D，HEINZ V，BUCKOW R.High pressure application for food biopolymers[J].Biochim ica et Biophysica Acta-Proteins and Proteom ics，2006，1764（3）：619-631.

[4]HEREMANS K.High pressure effects on proteins and other biomolecules[J].Annual Review of Biophysics and Bioengineering，1982（11）：1-21.

[5]EISENMENGER M J，REYESDC J I.High pressure enhancement of enzymes：A review[J].Enzyme and M icrobial Technology，2009，45（5）：331-347.

[6]NOELM，LOZANO P，COMBESD.Polyhydric alcohol protective effecton Rhizomucorm iehei lipase deactivation enhanced by pressureand temperature treatment[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2005，27（6）：375-380.

[7]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 23535—2009脂肪酶制劑[S].北京：中國標準出版社，2009.

[8]GOMESM R A，LEDWARD D A.Effect of high pressure treatment on the activity of some polyphenoloxidases[J].Food Chem istry，1996，56（1）：1-5.

[9]ZENG Qingmei，PAN Jian，XIEHuim ing，etal.Effectof high pressure treatmenton peroxidase（POD）activity in pear juice[J]. Transactions of the CSAE，2004，20（4）：199-202.（in Chinese）

[10]SUNM M C，CLARK D S.Pressure effects on activity and stability of hyperthermophilic enzymes[J].M ethods in Enzymology，2001，334：316-327.

[11]LIJianrong，YU Jian.Effectof high pressure treatments on enzyme activeness[J].Food Science and Technology，2006（9）：18-20.（in Chinese）

[12]張瑜.超高壓對脂肪酶活性的影響及其機制初探[D].無錫：江南大學，2012.

[13]尹曼.動態(tài)高壓微射流技術對脂肪酶活性與構象的影響[D].南昌：南昌大學，2011.

Effect of High Hydrostatic Pressure Treatment on the Enzyme Activity of Lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica

YANG Xinying1， CHEN Gang1， DU Huanmei2， MIAOMing2， FENG Biao*1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The study investigated the effects of pressure，temperature，dwell time and pH on the enzymeactivity of lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica（YLLIP2）in high hydrostatic pressure（HHP）treatment.Results showed that HHP improved the activity of YLLIP2 and pressure，temperature，dwell time and pH had significanteffectson the enzyme activity.Optimal parameterswere found by orthogonal test to be pressure 450 MPa，temperature 45℃，dwell time 10 m in and pH 7.5.The optimalpH was increased 0.5 in HHP.

high hydrostatic pressure，lipase，enzymatic activity

TS 201.2

A

1673—1689（2017）05—0519—05

2015-04-24

教育部博士點基金博導類項目（20130093110009）。

*通信作者：馮 骉（1953—），男，江蘇無錫人，法國博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品加工與配料方面研究。

E-mail：bfeng@jiangnan.edu.cn

楊新穎，陳剛，杜煥梅，等.超高壓對解脂耶氏酵母脂肪酶酶活的影響[J].食品與生物技術學報，2017，36（02）：519-523.