腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

常曉東，楊有芹，薛痕，甘華

(1.雅安市人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，四川 雅安 625000；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400016)

腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

常曉東1，楊有芹1，薛痕1，甘華2

(1.雅安市人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，四川 雅安 625000；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400016)

目的：探討腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響。方法：30只雄性SD大鼠隨機分為3組：正常對照組(n=10)；糖尿病腎病組(n=10)；腎炎康復片組(n=10)。16周后檢測大鼠24h尿蛋白及血肝腎功水平。光鏡觀察大鼠腎組織病理改變。免疫組化方法檢測大鼠腎臟葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)、p-JNK的表達。TUNEL檢測腎組織凋亡細胞。RT-PCR檢測腎組織GRP78mRNA、CHOPmRNA的表達。結(jié)果：18周時，糖尿病腎病組、腎炎康復片組24h尿蛋白水平、血清尿素及肌酐水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)，血白蛋白水平低于正常對照組。腎炎康復片組血清尿素及肌酐水平較糖尿病腎病組明顯降低。糖尿病腎病組、腎炎康復片組GRP78、JNK、生長阻滯和DNA誘導基因153(growtharrestandDNAdamage-induciblegene153，CHOP)表達顯著高于正常對照組(P<0.05)，腎炎康復片組較糖尿病腎病組表達明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了糖尿病腎病的發(fā)生，腎炎康復片可以通過抑制腎臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應而起腎臟保護作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；生長阻滯和DNA誘導基因153

糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥，也是引起終末期腎病的主要原因之一。糖尿病腎病發(fā)病機制目前不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞的重要細胞器，其對穩(wěn)定細胞功能起著重要作用。但各種病理因素會引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能發(fā)生紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[1]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以促進細胞穩(wěn)態(tài)的恢復，但是持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會引起細胞的凋亡[2]。研究表明：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了糖尿病腎病的發(fā)生[3]。腎炎康復片可以延緩糖尿病腎病的發(fā)展[4]。但關于腎炎康復片對糖尿病腎病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，研究的較少。本研究擬觀察腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，從而探討腎炎康復片延緩糖尿病腎病發(fā)展的機制。

1 材料及方法

1.1 糖尿病腎病大鼠模型的建立

選30只體質(zhì)量200～220 g的雄性健康SD清潔級大鼠(重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，適應性喂養(yǎng)1周后，采用注射鏈脲菌素(STZ，美國Sigma)方法，將STZ配制成濃度為1%的溶液，按40 mg/kg腹腔內(nèi) 1 次性注射。STZ腹腔注射兩周，尿常規(guī)測定出現(xiàn)尿微量蛋白定性陽性。判定為糖尿病腎病形成。選取20只作為實驗組。另外選取10只正常對照組。糖尿病腎病大鼠分為糖尿病腎病組(n=10)及腎炎康復片組(n=10)。腎炎康復片組給予腎炎康復片(天津同仁堂藥業(yè)0.48 g×45片)3次/d，3片/次灌胃。

1.2 標本收集

各組大鼠喂養(yǎng)16周后收集標本。大鼠處死前1 d天收集24 h尿液，作24 h尿蛋白檢測。處死大鼠前收集血液標本，標本離心后留取血清-20 ℃凍存?zhèn)渥魃瘷z查。處死大鼠后取出腎臟用生理鹽水沖洗，觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地，留取部分腎組織行光鏡檢查、免疫組化、TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色及RT-PCR。

1.3 血生化及尿蛋白測定

血肝腎功能由全自動生化儀檢測。尿蛋白測定采用考馬斯亮藍方法。

1.4 大鼠腎組織病理學檢查

肉眼觀察腎臟外觀情況，4%多聚甲醛固定標本作4 μm石蠟切片，進行HE染色。同時新免疫組化染色并進行免疫組化圖像分析。

1.5 TUNEL方法檢測腎組織細胞凋亡及結(jié)果判斷

采用TUNEL方法監(jiān)測腎組織凋亡細胞情況。

1.6 RT-PCR法測定葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、生長阻滯和DNA誘導基因153 mRNA的表達

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法測定葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)及生長阻滯和DNA誘導基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，CHOP)mRNA。其引物如表1。

表1 GRP78、CHOP mRNA引物

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠24 h尿蛋白的變化

與正常對照組相比，糖尿病腎病組大鼠24 h尿蛋白明顯增加(P<0.01)，腎炎康復片組大鼠24 h尿蛋白低于糖尿病腎病組(P<0.05)。各組大鼠24 h尿蛋白的變化見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白的變化

*P<0.01，#P<0.05，與正常對照組比較；△P<0.05，與糖尿病腎病組比較。

2.2 各組大鼠肝腎功能情況

糖尿病腎病組、腎炎康復片組血清尿素及肌酐水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)，血白蛋白水平低于正常對照組。腎炎康復片組血清尿毒及肌酐水平較糖尿病腎病組明顯降低(P<0.05)，血白蛋白水平較正常對照組升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血肝腎功能水平

*P<0.01，#P<0.05與正常對照組比較；△P<0.05，與糖尿病腎病組比較。

2.3 大鼠腎組織病理學檢查

正常對照組腎小球結(jié)構清晰，無腎小球硬化，無系膜細胞增生。糖尿病腎病組大鼠腎小球系膜細胞增生明顯，有腎小球節(jié)段性硬化。而腎炎康復片組腎臟病理改變較高糖尿病腎病組明顯減輕。見圖1。

2.4 大鼠腎組織免疫組化分析

2.4.1 腎組織GRP78蛋白的表達 糖尿病腎病組大鼠腎組織GRP78蛋白表達叫正常對照組較多。腎炎康復片組大鼠腎組織GRP78蛋白表達較糖尿病腎病組明顯降低(P<0.05)，但高于正常對照組(P<0.05)。見圖2。

2.4.2 腎組織p-JNK蛋白的表達 糖尿病腎病組大鼠腎組織p-JNK蛋白表達較正常對照組明顯較多(P<0.05)。腎炎康復片組大鼠腎組織p-JNK蛋白表達較糖尿病腎病明顯降低(P<0.05)，但高于正常對照組(P<0.05)。見圖3。

2.5 腎組織凋亡細胞檢測

糖尿病腎病大鼠腎組織凋亡細胞較正常對照組明顯增多(P<0.01)。腎炎康復片組大鼠腎組織凋亡細胞較糖尿病腎病組明顯減少(P<0.05)，但較正常對照組明顯增多(P<0.05)。見圖4。

2.6 RT-PCR檢測大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA的表達

糖尿病腎病組大鼠腎組織GRP78 mRNA表達較正常對照組明顯增強。而腎炎康復片組大鼠腎組織GRP78 mRNA的表達較糖尿病腎病組明顯減弱，但強于正常對照組。見圖5。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的并發(fā)癥。在我國，糖尿病腎病是引起終末期腎病的第二位原因。據(jù)統(tǒng)計,到 2025 年為止,我國糖尿病的人數(shù)將達到3.8億,據(jù)估計大約20% 的糖尿病患者會發(fā)展成為糖尿病腎病。糖尿病腎病的發(fā)病機制十分復雜,其確切的機制尚未完全闡明。糖尿病腎病的主要特點是腎小球過度肥大、系膜增生、基底膜增厚最終引起腎小球硬化,細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下發(fā)生的程序性細胞死亡。許多疾病的發(fā)生與細胞凋亡有關。研究發(fā)現(xiàn)，腎固有細胞的凋亡與腎功能的惡化及腎小球的硬化有關[5]。多種腎臟疾病中均存在著腎固有細胞的凋亡。細胞凋亡也參與了糖尿病腎病的發(fā)生[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠，腎固有細胞凋亡明顯增加。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)的合成方面起著重要的作用。但是各種病理因素會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能發(fā)生紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對機體起保護作用，可以促進細胞穩(wěn)態(tài)的恢復，但是持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會引起細胞的凋亡。GRP78，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中可以幫助蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正確折疊，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中表達明顯增加。CHOP屬促凋亡轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2而引起細胞的凋亡。CHOP在生理情況下表達較少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時其表達顯著增加。通過抑制CHOP的表達，可明顯減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡。而促進CHOP的表達，則加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡[7]。JNK屬于絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可激活信號調(diào)節(jié)激酶1 (apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)，進而引起JNK的磷酸化而引起細胞的凋亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了多種因素引起腎臟損傷。吳小瑋等[9]研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎功能衰竭患者腎組織GRP78表達與24 h尿蛋白成正比。還有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也參與了糖尿病腎病的發(fā)生[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、CHOP、JNK表達明顯增加。這提示：抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能延緩糖尿病腎病發(fā)展。

腎炎康復片由西洋參、人參、地黃、杜仲(炒)、山藥、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹參、澤瀉、白茅根、桔梗組成。具有益氣養(yǎng)陰，補腎健脾，清解余毒等。許多研究表明腎炎康復片可以延緩糖尿病腎病發(fā)展[11]。但其確切機制不明確。本研究發(fā)現(xiàn)腎炎康復片可以降低糖尿病大鼠蛋白尿，延緩腎功能惡化。同時發(fā)現(xiàn)，腎炎康復片可以減少糖尿病腎病大鼠GRP78、CHOP、JNK表達，同時減少腎固有細胞的凋亡。這提示腎炎康復片可能通過抑制糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的腎固有細胞的凋亡而延緩糖尿病腎病大鼠腎功能惡化。

總之，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了糖尿病腎病的發(fā)展，而腎炎康復片可以抑制糖尿病腎病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，提示腎炎康復片可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激延緩糖尿病腎病發(fā)展。

[1] Dickhout JG,Krepinsky JC.Endoplasmic reticulum stress and renal disease[J].Antioxid Redox Signal,2009,11(9):2341-2352.

[2] Civelek M,Manduchi E,Riley RJ,etal.Chronic endoplasmic reticulum stress activates unfolded protein response in arterial endothelium in regions of susceptibility to atherosclerosis[J].Circ Res,2009,105(5):453-461.

[3] Cao AL,Wang L,Chen X,etal.Ursodeoxycholic acid and 4-phenylbutyrate prevent endoplasmic reticulum stress-induced podocyte apoptosis in diabetic nephropathy[J].Lab Invest，2016,96(6):610-622.

[4] 王海潔.腎炎康復片對糖尿病腎病患者的療效分析[J].糖尿病新世界，2016,10(14)：27-28.

[5] Chihara Y,Ono H,Ishimitsu T,etal.Roles of TGF-beta1 and apoptosis in the progression of glomerulosclerosis in human IgA nephropathy[J].Clin Nephrol,2006,65(6):385-392.

[6] Menini S,Iacobini C,Oddi G,etal.Increased glomerular cell (podocyte) apoptosis in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus:role in the development of diabetic glomerular disease[J].Diabetologia,2007,50(12):2591-2599.

[7] Sun X,Liao W,Wang J,etal.CSTMP induces apoptosis and mitochondrial dysfunction in human myeloma RPMI8226 cells via CHOP-dependent endoplasmic reticulum stress[J].Biomed Pharmacother，2016,83:776-784.

[8] Win S,Than TA,Fernandez-Checa JC,etal.JNK interaction with Sab mediates ER stress induced inhibition of mitochondrial respiration and cell death[J].Cell Death Dis，2014，5(1):e989.

[9] 吳小瑋，何婭妮，丁涵，等.慢性腎臟病患者腎小管上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與細胞凋亡的關系[J].第三軍醫(yī)大學學報，2008，30(11):1010-1013.

[10]Tao JL,Wen YB,Shi BY,etal.Endoplasmic reticulum stress is involved in podocyte apoptosis induced by saturated fatty acid palmitate[J].Chin Med J (Engl)， 2012，125(17):3137-3142.

[11]王謙，楊國旭，蔡雯婷，等.腎炎康復片聯(lián)合 ARB 類降壓藥治療糖尿病腎病 隨機對照試驗的Meta分析[J].中醫(yī)臨床研究，2016,8(13)：1-5.

(學術編輯：謝席勝)

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The effect of Shenyankangfu tablets on endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy rats

CHANG Xiao-dong1,YANG You-qin1,XUE Hen1,GAN Hua2

(DepartmentofNephrology,1.Ya’anPeople’sHospital,Ya’an625000,Sichuan；2.TheFirstAffliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective：To investigate the effect of Shenyankangfu tablets on endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy rats.Methods：30 male SD rats were randomly divided into three groups:normal control group (n=10),diabetic nephropathy group (n=10) and Shenyankangfu tablets group (n=10).24 h after 16 weeks,the levels of urine protein and serum hepatic and renal function were detected.The pathological changes of renal tissue in rats were observed with light microscope.The expression of glucose regulated protein 78(GRP78) and p-JNK in rat kidney was detected by immunohistochemistry method.Detection of apoptosis cells in renal tissues with TUNEL.The expression of mRNA GRP78 and mRNA CHOP in renal tissues was detected by RT-PCR.Results:At 18 weeks,diabetic nephropathy group,Shenyankangfu tablets group 24 h urine protein level,serum urea and creatinine levels were significantly higher than the normal control group (P<0.05),serum albumin level was lower than the normal control group.The serum urea and creatinine levels in Shenyankangfu tablets group were significantly decreased than the diabetic nephropathy group.The expression of GRP78,JNK,growth arrest and DNA damage-inducible gene 153(CHOP) in Shenyankangfu tablets group and diabetic nephropathy group was significantly higher than the normal control group (P<0.05),and those in Shenyankangfu tablets group was significanly decreased than the diabetic nephropathy group (P<0.05).Conclusion:The endoplasmic reticulum stress is involved in the occurrence of diabetic nephropathy,Shenyankangfu tablets can play a role in renal protection by inhibition of endoplasmic reticulum stress in the kidney

Endoplasmic reticulum stress;Glucose regulated protein78；Growth arrest and DNA damage-inducible gene 153

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.030

2016-10-26

常曉東(1981-)，男，碩士。E-mail:changxiaodong168@163.com

時間：2017-6-21 18∶10 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1810.060.html

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