T淋巴細(xì)胞用于腫瘤過繼細(xì)胞治療的研究進(jìn)展

周玉川，肖東琴，馮剛，李光明

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000)

T淋巴細(xì)胞用于腫瘤過繼細(xì)胞治療的研究進(jìn)展

周玉川，肖東琴，馮剛，李光明

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000)

自從Burnet和Thomas創(chuàng)立并完善免疫監(jiān)視學(xué)說以來，醫(yī)學(xué)界研究人員清楚地認(rèn)識到免疫系統(tǒng)，尤其是T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤過程中的重要作用，因而出現(xiàn)了一系列改造和利用T細(xì)胞預(yù)防甚至殺滅腫瘤的研究。此外，過繼性細(xì)胞治療作為當(dāng)前有效的治療手段，特別是基于改造后的T淋巴細(xì)胞(如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞受體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，嵌合抗原受體T細(xì)胞)用于人體腫瘤的治療，取得了極大的療效，引起了人們的廣泛關(guān)注。本文就T淋巴細(xì)胞用于腫瘤過繼細(xì)胞治療的最新的研究進(jìn)展做如下綜述。

T細(xì)胞；腫瘤；過繼細(xì)胞治療

近年來，腫瘤在我國的發(fā)病率越來越高[1]，手術(shù)、放療、化療作為目前治療腫瘤的主要手段，存在手術(shù)傷害大，放化療副作用大等問題。這導(dǎo)致患者總體生活質(zhì)量低下，并且經(jīng)過這些治療，大多數(shù)患者還是會復(fù)發(fā)。面對這些難題，科研人員致力于開發(fā)更高效的腫瘤治療手段。自上世紀(jì)八十年代，Rosenberg等[2]在體外運(yùn)用腫瘤過繼細(xì)胞(adoptive cell transfer, ACT)治療黑色素瘤取得良好的治療效果，ACT療法用于腫瘤治療經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，至今成為全球腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。

1 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)用于腫瘤治療的研究

當(dāng)人體有腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，免疫細(xì)胞如T 細(xì)胞, B 細(xì)胞, 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NKs), 單核巨噬細(xì)胞(Macrophages)等可浸入腫瘤組織并殺傷腫瘤，這便是TIL。其中最主要的抗腫瘤細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞，它可通過主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)限制性識別腫瘤細(xì)胞表面出現(xiàn)的特異性抗原并殺傷腫瘤，使人體保持健康。但是，隨著腫瘤負(fù)荷增加，能特異識別腫瘤細(xì)胞表面抗原的T細(xì)胞數(shù)量不足以清除腫瘤。鑒于此，Rosenberg等[3]運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對TIL進(jìn)行大量擴(kuò)增，再將擴(kuò)增后的TIL回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使腫瘤患者病情緩解，至此，TIL開始運(yùn)用于人體試驗(yàn)[4]。

自TIL問世以來，最常用于黑色素瘤的治療。最初TIL治療腫瘤包含一系列復(fù)雜的過程，首先要利用外科手術(shù)切除多個(gè)病灶，然后體外分離出TIL，經(jīng)過細(xì)胞毒性測試，體外培養(yǎng)2～3個(gè)星期獲得大量細(xì)胞后，再運(yùn)用于患者的治療。然而，這些臨床試驗(yàn)也逐步暴露出制作時(shí)間長，分離和擴(kuò)增TIL困難以及細(xì)胞毒性測試?yán)щy等問題[5]。為此，研究人員去除了TIL毒性檢測，縮短了TIL的培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)胞質(zhì)量卻與之前相似。分析原因是短時(shí)間培養(yǎng)的TIL純度高，突變少，細(xì)胞端粒長，進(jìn)入體內(nèi)的復(fù)制能力強(qiáng)，且傳代少的細(xì)胞高表達(dá)共刺激因子CD27,CD28，4-1BB等，因此抗腫瘤能力強(qiáng)[6-7]。

TIL殺傷腫瘤細(xì)胞的重要原因在于TIL能通過MHC限制性識別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原。鑒于此，1991年Bruggen用一名黑色素瘤患者的TIL克隆出了腫瘤抗原，即MZ2-E[8]，在此基礎(chǔ)上,更多腫瘤特異性抗原被篩選出來[9-10]。這些特異性抗原存在于各種腫瘤組織中。目前治療黑色素瘤的TIL識別的抗原有以下幾種：(1)黑色素細(xì)胞分化抗原，如MART-1和gp100，這些抗原存在于所有的黑色素細(xì)胞中，不論正常還是惡性組織，雖然TIL能識別并提取這些抗原，但針對這些抗原的細(xì)胞毒性作用并未觀察到，是否具有抗腫瘤作用也不清楚；(2)癌胚抗原，如NY-eso-1[11]，MAGE[12]。這類抗原屬于腫瘤共同特異性抗原，即抗原在多種腫瘤中表達(dá)。這類抗原多定位于X染色體，表達(dá)于胚胎組織或生殖系統(tǒng)中，在成年人正常組織中極少表達(dá)；(3)抗原存在于正常組織和腫瘤組織中，但在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，如Meloe-1[13]，因基因表觀遺傳學(xué)的改變，導(dǎo)致了該蛋白的過表達(dá)；(4)基因突變所致的新抗原，包括CDK4和β-catenin[14]，雖然基因突變所出現(xiàn)的新抗原是腫瘤所獨(dú)有且稀少的，但TIL識別這些抗原后并不產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，具體機(jī)制不明，可能與腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視有關(guān)。

鑒于TIL治療黑色素瘤所取得的成功，研究人員迫切希望驗(yàn)證TIL在其他實(shí)體瘤上的效果，先后有宮頸癌、卵巢癌、腎癌、胃腸道腫瘤、頭頸部鱗癌等納入研究[15]。盡管TIL治療黑色素瘤表現(xiàn)出了強(qiáng)大的細(xì)胞增殖能力和殺傷作用，但在其他腫瘤中并未出現(xiàn)類似療效，至今仍不清楚TIL在這些腫瘤中到底識別哪些腫瘤抗原以及為何不產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。但是正是這些嘗試，使得TIL細(xì)胞的提取擴(kuò)增有了更多選擇方法，為后續(xù)的臨床應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

2 基因改造的T細(xì)胞(genetically engineered T cells)用于腫瘤治療的研究

2.1 TCR-T和CAR-T的技術(shù)原理

TIL可使部分黑色素瘤患者病情緩解，但其治療范圍窄，總體有效率低。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將目的基因轉(zhuǎn)入人類外周血T細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)已經(jīng)成熟，運(yùn)用慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計(jì)的抗腫瘤免疫細(xì)胞也已在許多患者體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[16]。至今，已成功制備出T細(xì)胞受體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞(t-cell receptor genetically transdused T cells,TCR-T)和嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)，它們的出現(xiàn)大大提高了抗腫瘤的效率和范圍。TCR-T的制備與TIL成功治療黑色素瘤有關(guān)。在TIL通過MHC限制性識別抗原并殺傷腫瘤后，利用基因克隆技術(shù)獲取該段TCR序列[17]，再利用載體將該段基因轉(zhuǎn)染至更多的T細(xì)胞上，使識別該抗原的T細(xì)胞上萬倍的增長，這就是TCR-T的技術(shù)原理。而CAR-T最初由Eshhar和同事在1993年設(shè)計(jì)[18]，它的基本原理是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將能識別腫瘤表面抗原的單鏈抗體(single chain variable fragment,scFv)[19]、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號識別區(qū)依次表達(dá)于T細(xì)胞。CAR-T在識別位于腫瘤細(xì)胞表面的抗原后被激活，然后無MHC 限制性直接殺傷腫瘤細(xì)胞。正常的人體免疫系統(tǒng)清除腫瘤必須依賴MHC的限制性，然而大多數(shù)腫瘤通過調(diào)節(jié)或不表達(dá)MHC來逃避T細(xì)胞的監(jiān)視，基于此，基因改造后的CAR-T能有效的清除腫瘤細(xì)胞。

2.2 TCR-T和CAR-T的結(jié)構(gòu)

TCR-T的結(jié)構(gòu)簡單，其本身來源于正常的人體TCR，它是識別了抗原肽-MHC分子復(fù)合物(peptide-MHC)的特定TCR，含有特定的序列。運(yùn)用基因克隆技術(shù)將該TCR的基因轉(zhuǎn)染至其他T細(xì)胞內(nèi)便可成功制備。

而相對于TCR-T，CAR-T的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，制備更困難，一般可分成四部分，即抗原識別區(qū)，鉸鏈連接區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)?？乖R別區(qū)即scFv，它是能識別抗原的免疫球蛋白的最小單位，來源于各種單克隆抗體。為了優(yōu)化抗原識別效率，Grada等[20]將兩個(gè)不同的scFv通過鉸鏈串聯(lián)起來，可同時(shí)識別兩種不同的抗原，可以更精確的靶定腫瘤細(xì)胞。鉸鏈連接區(qū)，它是連接抗原識別區(qū)和T細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。普遍認(rèn)為鉸鏈連接區(qū)與胞內(nèi)信號激活、抗原識別區(qū)的活動(dòng)度、調(diào)節(jié)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的反應(yīng)距離有關(guān)。鉸鏈連接區(qū)由IgG亞類的基因編碼,如IgG1，IgG4，IgD，CD8，最常用的是IgG1[21]。需要指出的是，鉸鏈連接區(qū)并不是必須具備的結(jié)構(gòu)。以CD3ζ為胞內(nèi)信號傳遞的CARs需要鉸鏈連接作為信號傳遞，而以FcεRIγ為胞內(nèi)信號傳遞的CARs不需要[22]。CARs識別抗原表位碳端需要鉸鏈連接區(qū)，識別抗原表位為氮端則不需要[23]?？缒^(qū)和鉸鏈連接區(qū)相似，來源于CD3、CD4、CD8、CD28跨膜基因區(qū)段[24]?？偟膩碚f，鉸鏈連接區(qū)和跨膜區(qū)的雖然不是整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的最重要的組分，但它們在抗原識別與信號傳導(dǎo)中發(fā)揮了積極作用。胞內(nèi)區(qū)來源于淋巴細(xì)胞信號啟動(dòng)分子，這些分子啟動(dòng)后可產(chǎn)生一系列免疫效應(yīng)，如激活T細(xì)胞，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮免疫細(xì)胞毒性反應(yīng)等。根據(jù)胞內(nèi)信號分子的組成不同可將CAR-T分成四代。第一代的CARs的胞內(nèi)信號僅由TCR/CD3復(fù)合物的ζ鏈或IgE高親和力受體γ鏈(FcεRIγ)組成[25]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也觀察到了T細(xì)胞增殖，但細(xì)胞毒性弱，增殖能力不強(qiáng)。分析原因是腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受，導(dǎo)致共刺激分子缺失，導(dǎo)致T細(xì)胞失能。因此便有了加入一個(gè)共刺激分子信號與CD3ζ串聯(lián)的第二代CAR-T，因?yàn)門細(xì)胞激活的共刺激分子可有多個(gè)，又設(shè)計(jì)了含兩個(gè)共刺激分子與CD3ζ串聯(lián)的第三代CAR-T。目前常用的共刺激分子是CD28、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)[26]。第四代CAR-T在第二代和第三代的基礎(chǔ)上，對CAR-T做了各種各樣的改造，這些改造后的細(xì)胞可產(chǎn)生各種免疫增強(qiáng)效應(yīng)，減輕副作用。為了將免疫細(xì)胞聚集在腫瘤位點(diǎn)，可在細(xì)胞上共表達(dá)CXCR2、CCR4、CCR2b、VEGFR2等細(xì)胞因子受體[27]。此外，為了提高CAR-T的生存期和增殖能力，研究人員選用了增殖能力強(qiáng)的記憶細(xì)胞來基因改造，觀察到短期內(nèi)細(xì)胞增殖活躍。同時(shí)基因改造后的細(xì)胞共表達(dá)IL12，IL15等細(xì)胞因子可延長細(xì)胞生存期，提高細(xì)胞活力[28-29]。為克服異體CAR-T所產(chǎn)生的移植物抗宿主病，采用RNA干擾技術(shù)敲除α和β鏈提高移植細(xì)胞的存活率[30]。免疫系統(tǒng)預(yù)防腫瘤失敗的重要原因是免疫抑制的問題，而為了解決這個(gè)問題，各種實(shí)驗(yàn)開展開來，如表達(dá)生存基因Bcl-X[31]，上調(diào)CD25的表達(dá)[32]，共表達(dá)4-1BBL或者CD40L[33]，然后抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg supression)，陰性表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)[34]等。利用抗NKG2D可改善實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境，提高抗腫瘤療效[35]。這些臨床試驗(yàn)都在一定程度上增強(qiáng)了CAR-T抗腫瘤療效。

2.3 TCR-T和CAR-T的臨床應(yīng)用

TCR-T和CAR-T是抗腫瘤的新方法，但療效不一。TCR-T來自于TCR，因此可識別來源于細(xì)胞核、胞漿、胞膜的各種抗原。與CAR-T相比，這是TCR-T的最大優(yōu)點(diǎn)。CAR-T的抗腫瘤效應(yīng)是通過抗原抗體反應(yīng)，因此理論上所有抗原均可設(shè)計(jì)成為scFv的靶點(diǎn)，現(xiàn)今用于研究的抗原有多種，包括蛋白質(zhì)，蛋白多糖，高度糖基化蛋白，神經(jīng)節(jié)苷脂，糖類等[24]，這些位于腫瘤細(xì)胞表面的抗原大多數(shù)屬于腫瘤相關(guān)抗原(tumor association antigen，TAA)。

利用抗CD19的CAR-T治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)，病人出現(xiàn)完全緩解[36]。此后CAR-T治療腫瘤的研究蓬勃發(fā)展。運(yùn)用抗CD19的CAR-T治療急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤，抗CD20治療淋巴瘤，抗Lewis Y antigen或CD33治療急性髓系白血病[37]，它們都在不同程度上取得了療效。在血液系統(tǒng)腫瘤之外，抗實(shí)體瘤也做了大量實(shí)驗(yàn)， 針對的抗原有Mesothelin，EGFRvⅢ，GD2，HER2，CD171，CEA，PSMA，CAⅨ，IL13等[38]。這一系列實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)過腫瘤完全緩解(抗GD2)[39]，但總體而言，CAR-T針對實(shí)體瘤還療效甚微。

2.4 TCR-T和CAR-T的安全性

運(yùn)用基因改造的T細(xì)胞治療腫瘤雖然取得了一定的療效，但同時(shí)出現(xiàn)了很多安全性問題。TCR-T臨床試驗(yàn)從治療黑色素瘤開始，它識別的TAA是MART-1和gp100，治療后患者病情緩解，但出現(xiàn)了皮疹，白癜風(fēng)，聽覺視覺障礙等副作用[40]。在抗CEA的的臨床試驗(yàn)中，病人出現(xiàn)了更嚴(yán)重的致死性的腸炎[41]，在抗MAGE-A3的一系列試驗(yàn)中，病人出現(xiàn)了腦毒性和心臟毒性導(dǎo)致病人死亡[42]，這些使得TCR-T的應(yīng)用前景堪憂。為了規(guī)避巨大的副作用，NY-ESO1[43]，一種癌胚抗原，同時(shí)也是腫瘤特異性抗原的TCR-T被應(yīng)用于臨床，取得良好的療效，患者體內(nèi)未觀察到副作用。這又為TCR-T的臨床試驗(yàn)開辟了新路，雖然還未有其他相關(guān)報(bào)道，但研究已經(jīng)在許多實(shí)驗(yàn)室開展。

自從克服了第一代CAR-T增殖過低，細(xì)胞失能的問題，后面幾代CAR-T又走到了反面，即增殖能力強(qiáng)、細(xì)胞毒性強(qiáng)導(dǎo)致的安全性問題。不管是TCR-T治療黑色素瘤出現(xiàn)的皮膚病變和眼耳毒性，還是最初抗CAⅨ的CAR-T導(dǎo)致了病人出現(xiàn)膽汁郁積癥[44]，以及后來試驗(yàn)中出現(xiàn)的更嚴(yán)重的副作用，他們產(chǎn)生的原因都是細(xì)胞毒性反應(yīng)。這些細(xì)胞毒性反應(yīng)分成兩種情況，其一是殺瘤效應(yīng)可產(chǎn)生具有致死性的細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndromes，CRS)，巨噬細(xì)胞激活綜合征(macrophage activation syndromes，MAS)，以及神經(jīng)毒性和融瘤綜合征(tumor lysis syndrome，TLS)。這些副作用主要發(fā)生于CAR-T治療腫瘤時(shí)。因?yàn)镃AR-T進(jìn)入體內(nèi)可迅速發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，可短時(shí)間釋放大量的細(xì)胞炎癥因子，如IL6，TNFα，INFγ，繼而患者出現(xiàn)高血壓，高熱，缺氧甚至嚴(yán)重到器官衰竭而死[45]。雖然可運(yùn)用炎癥因子抑制劑和激素抗炎治療，但細(xì)胞因子釋放綜合征發(fā)展迅速，需要及時(shí)對癥治療，因此是臨床試驗(yàn)必須重視的問題。第二個(gè)問題是殺傷腫瘤組織的同時(shí)對正常組織的破壞，這是TCR-T產(chǎn)生副作用的主要機(jī)制[46]，而CAR-T經(jīng)過基因改造后，識別殺傷目標(biāo)細(xì)胞無MHC限制性，且目標(biāo)抗原多數(shù)是腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原可于正常組織中表達(dá)，因此CAR-T攻擊腫瘤細(xì)胞時(shí)也會殺傷正常組織(表1)。例如在最有效的抗CD19CAR-T中，CD19表達(dá)于所有的B淋巴細(xì)胞，因此必須在實(shí)驗(yàn)前去除外周血中表達(dá)CD19的淋巴細(xì)胞，而治療后的人體會出現(xiàn)B細(xì)胞缺乏癥，這樣會導(dǎo)致人體體液免疫缺失，病人必須輸注丙種球蛋白。還有基因改造后的免疫細(xì)胞本身就具有免疫原性，不管是轉(zhuǎn)染時(shí)所用的載體還是來源于鼠類的抗體(scFv)，都具有潛在的治病性。

2.5 TCR-T和CAR-T發(fā)展方向

面對已經(jīng)出現(xiàn)的問題，研究人員綜合各種理論，運(yùn)用新技術(shù)優(yōu)化CAR-T的結(jié)構(gòu)，為解決增殖能力強(qiáng)，效應(yīng)細(xì)胞過多的問題。研究人員設(shè)計(jì)了在mRNA基礎(chǔ)上基因改造的CAR-T[47]，改造后的細(xì)胞不會增殖。另一種方案是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)引入自殺基因[48]，這種方案可清除過量的細(xì)胞。然而又因?yàn)闀簳r(shí)性表達(dá)導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)了針對CAR-T的過敏反應(yīng)[49]，且轉(zhuǎn)染的基因來源于其他動(dòng)物本身可能會產(chǎn)生免疫原性，即使采用人體自身的抗體制成的CAR-T，也在后續(xù)的試驗(yàn)中證實(shí)療效不好[50]。在轉(zhuǎn)染基因序列中加入剪切后的上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor to generate a small,truncated derivative，tEGFR)，運(yùn)用西妥昔單抗可清除載有tEGFR的CAR-T[51]，因此可有效清除過量的免疫細(xì)胞。為了解決脫靶效應(yīng)，科研人員致力于提高CAR-T識別腫瘤細(xì)胞的特異性，設(shè)計(jì)了雙靶點(diǎn)的的CAR-T，即需要同時(shí)識別腫瘤細(xì)胞上的(A+B)兩種抗原才發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，令一種方案抗原識別方案是(A+非B)或(非A+B)，這兩種方案都能顯著提高識別腫瘤細(xì)胞的特異性[52]。最新的研究設(shè)計(jì)了一種可識別腫瘤細(xì)胞表面抗原密度的scFv，這種scFv與抗原低表達(dá)的正常細(xì)胞不反應(yīng)，必須達(dá)到反應(yīng)所需的抗原密度才與之反應(yīng)[53]。此外，還有利用最新的睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來基因工程改造T細(xì)胞[54]，可降低潛在的病毒載體免疫原性。

表1 3種免疫細(xì)胞的比較

3 總結(jié)

隨著人們對腫瘤認(rèn)識的深入，越來越多的人認(rèn)識到免疫系統(tǒng)對人體的重要作用?；蚋脑旌蟮拿庖呒?xì)胞作為一種高效的抗腫瘤技術(shù)，為人類最終戰(zhàn)勝腫瘤提供了可行性。隨著各種配套技術(shù)提高，在精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)上，運(yùn)用基因組學(xué)，蛋白組學(xué)等手段尋找到更高效，特異性更強(qiáng)的腫瘤抗原，將是人類治愈腫瘤的突破口。

[1] Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China 2015[J].CA Cancer J Clin，2016,66(2):115-132.

[2] Rosenberg SA,Lotze MT,Muul LM,etal.Observations on the systemic administration of autologous lymphkine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer[J].Cell Immunol，2012,278(1-2):21-26.

[3] Rosenberg SA,Packard BS,Aebersold PM,etal.Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma.A preliminary report[J].N Engl J Med，1988,319(25):1676-1680.

[4] Dudley ME,Gross CA,Langhan MM,etal. CD8+ enriched “young” tumor infiltrating lymphocytes can mediate regression of metastatic melanoma[J].Clin Cancer Res,2010,16(24):6122-6131.

[5] Dudley ME,Wunderlich JR,Yang JC,etal.Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma[J].J Clin Oncol,2005,23(10):2346-2357.

[6] Itzhaki O,Hovav E,Ziporen Y,etal.Establishment and large-scale expansion of minimally cultured “young” tumor infiltrating lymphocytes for adoptive transfer therapy[J].J Immunother,2011,34(2):212-220.

[7] Radvanyi LG,Bernatchez C,Zhang M,etal.Specific lymphocyte subsets predict response to adoptivecell therapy using expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes in metastatic melanoma patients[J].Clin Cancer Res,2012,18(24):6758-6770.

[8] Van der Bruggen P,Traversari C,Chomez P,etal.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma[J].Science,1991,254(5038):1643-1647.

[9] Verdegaal EM,de Miranda NF,Visser M,etal.Neoantigen landscape dynamics during human melanoma-T cell interactions [J].Nature,2016,536(7614):91-95.

[10]Kawakami Y,Eliyahu S,Delgado CH,etal.Cloning of the gene coding for a shared human melanoma antigen recognized by autologous T cells infiltrating into tumor[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(9):3515-3519.

[11]Tarnowski M,Czerewaty M,Deskur A,etal.Expression of Cancer Testis Antigens in Colorectal Cancer:New Prognostic and Therapeutic Implications[J].Dis Marker,20162016:1987505.

[12]Scanlan MJ,Welt S,Gordon CM,etal.Cancer-related serological recognition of human colon cancer:identification of potential diagnostic and immunotherapeutic targets[J].Cancer Res,2002,62(14):4041-4047.

[13]Godet Y,Moreau-Aubry A,Guilloux Y,etal.MELOE-1 is a new antigen overexpressed in melanomas and involved in adoptive T cell transfer efficiency[J].J Exp Med,2008,205(11):2673-2682.

[14]Wang RF,Rosenberg SA.Human tumor antigens recognized by T lymphocytes:implications for cancer therapy[J].J Leukoc Biol,1996,60(3):296-309.

[15]Geukes Foppen MH,Donia M,Svane IM,etal.Tumor-infiltrating lymphocytes for the treatment of metastatic cancer[J].Mol Oncol,2015，9(10):1918-1935.

[16]June CH,Blazar BR,Riley JL.Engineering lymphocyte subsets:tools, trials and tribulations[J].Nat Rev Immunol,2009,9(10):704-716.

[17]Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,etal.Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes[J].Science,2006,314(5796):126-129.

[18]Esshar Z,Schindler DG,Waks T,etal.Targeting of T lymphocytes to Neu/HER2-expressing cells using chimeric single chain Fv receptors[J].J Immunol,1993,151(11):6577-6582.

[19]Yuasa N,Koyama T,Subedi GP,etal.Expression and structural characterization of anti-T-antigen single-chain antibodies (scFvs) and analysis of their binding to T-antigen by surface plasmon resonance and NMR spectroscopy[J].J Biochem.2013,154(6):521-529.

[20]Grada Z,Hegde M,Byrd T,etal.TanCAR: A Novel Bispecific Chimeric Antigen Receptor for Cancer Immunotherapy[J].Mol Ther Nucleic Acids,2013,2(192):e105.

[21]Kradin R,Kurnick J,Gifford J,etal.Adoptive immunotherapy with interleukin-2 (IL-2) results in diminished IL-2 production by stimulated peripheral blood lymphocytes[J].J Clin Immunol,1989，9(5):378-385.

[22]Shi H,Sun M,Liu L,etal.Chimeric antigen receptor for adoptive immunotherapy of cancer:latest research and future prospects[J].Mol Cancer,2014,13:219.

[23]Guest RD,Hawkins RE,Kirillova N,etal.The role of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors:evaluation of four different scFvs and antigens[J].J Immunother,2005,28(3):203-211.

[24]Dai H,Wang Y,Lu X,etal.Chimeric Antigen Receptors Modified T-Cells for Cancer Therapy[J].J Natl Cancer Inst,2016,108(7):djv439.

[25]Jensen MC,Riddell SR.Designing chimeric antigen receptors to effectively and safely target tumors[J].Curr Opin Immunol,2015,33:9-15.

[26]Vonderheide RH,June CH.Engineering T cells for cancer:our synthetic future[J].Immunol J Rev,2014,257(1):7-13.

[27]Chmielewski M,Kopecky C,Hombach AA,etal.IL-12 release by engineered T-cells expressing chimeric antigen receptors can effectively Muster an antigen-independent macrophage response on tumor cells that have shut down tumor antigen expression[J].Cancer Res,2011,71(17):5697-5706.

[28]Pegram HJ,Lee JC,Hayman EG,etal.Tumor-targeted T-cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning[J].Blood,2012,119(18):4133-4141.

[29]Hoyos V,Savoldo B,Quintarelli C,etal.Engineering CD19-specific T lymphocytes with interleukin-15 and a suicide gene to enhance their anti-lymphoma/leukemia effects and safety[J].Leukemia,2010,24(6):1160-1170.

[30]Torikai H,Cooper LJ.Translational Implications for Off-the-shelf Immune Cells Expressing Chimeric Antigen Receptors[J].Mol Ther,2016,24(7):1178-1186.

[31]Eaton D,Gilham DE,O’Neill A,etal.Retroviral transduction of human peripheral blood lymphocytes with Bcl-X(L) promotes in vitro lymphocyte survival in pro-apoptotic conditions[J].Gene Ther,2002,9(8):527-535.

[32]Chang ZL,Silver PA,Chen YY.Identification and selective expansion of functionally superior T cells expressing chimeric antigen receptors[J].J Transl Med,2015,13(1):1-16.

[33]Curran KJ,Seinstra BA,Nikhamin Y,etal.Enhancing antitumor efficacy of chimeric antigen receptor T cells through constitutive CD40L expression[J].Mol Ther,2015,23(4):769-778.

[34]Foster AE,Dotti G,Lu A,etal.Antitumor activity of EBV-specific T lymphocytes transduced with a dominant negative TGF-beta receptor[J].J Immunother,2008,31(5):500-505.

[35]Barber A, Rynda A, Sentman CL. Chimeric NKG2D expressing T-cells eliminate immunosuppression and activate immunity within the ovarian tumor microenvironment[J]. J Immunol, 2009, 183(11):6939-6947.

[36]Porter DL,Levine BL,Kalos M,etal.Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia[J].N Engl J Med,2011,365(8):725-733.

[37]Hossain NM,Chapuis AG,Walter RB.T-Cell Receptor-Engineered Cells for the Treatment of Hematologic Malignancies[J].Curr Hematol Malig Rep,2016,11(4):311-317.

[38]Klebanoff CA,Rosenberg SA,Restifo NP.Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers[J].Nat Med,2016,22(1):26-36.

[39]Louis CU,Savoldo B,Dotti G,etal.Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T-cells in patients with neuroblastoma[J].Blood,2011,118(23):6050-6056.

[40]Johnson LA,Morgan RA,Dudley ME,etal.Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen[J].Blood,2009,114(3):535-546.

[41]Parkhurst MR,Yang JC,Langan RC,etal.T cells targeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastatic colorectal cancer but induce severe transient colitis[J].Mol Ther,2011,19(3):620-626.

[42]Linette GP,Stadtmauer EA,Maus MV.etal.Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinityenhanced T cells in myeloma and melanoma[J].Blood,2013,122(6):863-871.

[43]Robbins PF,Morgan RA,Feldman SA,etal.Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1[J].J Clin Oncol,2011,29(7):917-924.

[44]Lamers CH,Sleijfer S,Vulto AG,etal.Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX:first clinical experience[J].Journal of Clinical Oncology,2006,24(13):e20- e22.

[45]Gross G,Eshhar Z. Therapeutic Potential of T Cell Chimeric Antigen Receptors (CARs) in Cancer Treatment:Counteracting Off-Tumor Toxicities for Safe CAR T Cell Therapy[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2016,56(1):59-83.

[46]Bendle GM,Linnemann C,Hooijkaas AI.etal.Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy[J].Nat. Med,2010，16(5):565-570.

[47]Zhao Y,Moon E,Carpenito C,etal.Multiple injections of electroporated autologous T-cells expressing a chimeric antigen receptor mediate regression of human disseminated tumor[J].Cancer Res,2010,70(22):9053-9061.

[48]Quintarelli C,Vera JF,Savoldo B,etal.Co-expression of cytokine and suicide genes to enhance the activity and safety of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes[J].Blood,2007,110(8):2793-2802.

[49]Maus MV,Haas AR,Beatty GL,etal.T-cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans[J].Cancer Immunol Res，2013,1(1):26-31.

[50]Song DG,Ye Q,Poussin M,etal.A fully human chimeric antigen receptor with potent activity against cancer cells but reduced risk for off-tumor toxicity[J].Oncotarget,2015,6(25):21533-21546.

[51]Wang X,Chang WC,Wong CW,etal.A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection,in vivo tracking,and ablation of engineered cells[J].Blood,2011,118(5):1255-1263.

[52]Fedorov VD,Themeli M,Sadelain M.PD-1-and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses[J].Sci Transl Med,2013,5(215):1283-1299.

[53]Caruso HG,Hurton LV,Najjar A,etal.Tuning Sensitivity of CAR to EGFR Density Limits Recognition of Normal Tissue While Maintaining Potent Antitumor Activity[J].Cancer Res,2015,75(17):3505-3518.

[54]Kacherovsky N,Liu GW,Jensen MC,etal.Multiplexed gene transfer to a human T-cell line by combining Sleeping Beauty transposon system with methotrexate selection[J].Biotechnol Bioeng,2015,112(7):1429-1436.

(學(xué)術(shù)編輯：馬代遠(yuǎn))

本刊網(wǎng)址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統(tǒng)：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

本刊網(wǎng)址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統(tǒng)：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.041

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2016JY0123)；四川省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(13TD0030)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃(CBY15-A-ZD01，CBY15-A-ZD06)

2016-09-12

周玉川(1990-)，男，碩士研究生。E-mail:zhouyuchuan1990@163.com

李光明，E-mail：liguangming9999@yahoo.com.cn

時(shí)間：2017-6-21 18∶11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1811.082.html

1005-3697(2017)03-0461-06

R730.5

A