嗜酸乳酸桿菌對實驗性潰瘍性結(jié)腸炎治療的最佳濃度探索及免疫學機制初探

陳琳琳，鄭倩

(1.中南大學湘雅醫(yī)院消化科，湖南 長沙 410000；2.郴州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 郴州 423000)

嗜酸乳酸桿菌對實驗性潰瘍性結(jié)腸炎治療的最佳濃度探索及免疫學機制初探

陳琳琳1，鄭倩2

(1.中南大學湘雅醫(yī)院消化科，湖南 長沙 410000；2.郴州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 郴州 423000)

目的：比較不同濃度嗜酸乳酸桿菌治療實驗性潰瘍性結(jié)腸炎(ulerativecolitis，UC)的療效，分析其對結(jié)腸近、遠端菌群的影響，尋找治療UC適宜的嗜酸乳酸桿菌濃度，并探索其免疫學機制。方法：雌性Balb/c小鼠56只，隨機分為7組(n=8)，葡聚糖硫酸鈉(DSS)造UC模型鼠，分別予以不同濃度嗜酸乳酸桿菌、激素、生理鹽水干預UC模型鼠，觀察小鼠一般情況，計算疾病活動指數(shù)(DAI) 評分、組織損傷評分，留取小鼠腸道組織進行腸道固生菌群分析，并進行PCR及Western-Blotting檢測UC相關的IL-23、IL-17、TNF-α。結(jié)果：106CFU/mL濃度級嗜酸乳酸桿菌干預組小鼠UC癥狀緩解最明顯，且遠端結(jié)腸益生菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)數(shù)量最多，致病菌(金黃色葡萄球菌)最低；UC相關的IL-23、IL-17、TNF-α無論mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，均為嗜酸乳酸桿菌干預組最低，尤其以106U/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃組最低。結(jié)論：嗜酸乳酸桿菌治療UC與其在結(jié)腸遠端有較高濃度乳酸桿菌有關，然而療效并非與細菌濃度完全正相關，炎性因子IL-23、IL-17、TNF-α與UC疾病嚴重程度呈正相關，與嗜酸乳酸桿菌對UC的治療作用相關。

嗜酸乳酸桿菌；菌群分析；實驗性結(jié)腸炎；免疫學機制；白細胞介素23；白細胞介素17

炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD) 和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因主要包括遺傳、免疫、環(huán)境等因素。近年來， 由于外界環(huán)境因素的改變，IBD發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[1]，這些現(xiàn)象說明外界環(huán)境對IBD的影響比遺傳更為重要。外界環(huán)境通過食物等與腸道接觸，對腸道菌群產(chǎn)生最直接的影響。由于IBD中的UC主要發(fā)病部位集中于有高濃度細菌的結(jié)直腸部位，無論臨床觀察、干預治療還是動物研究，均已證明UC的發(fā)生與腸道菌群異常密切相關，環(huán)境對UC的影響最終歸結(jié)于腸道細菌[2]。

研究表明益生菌對UC具有一定的療效。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，但仍為一種活菌制劑，具有繁殖、分泌等功能。補充大量的益生菌后是否會改變腸道細菌的種類和數(shù)量以及是否會產(chǎn)生潛在的致病性還不甚明確。已知UC的發(fā)病部位集中在結(jié)、直腸，根據(jù)細菌的定植特點，益生菌能否到達有效部位、細菌濃度以及與其它菌群的關系等都是影響其療效的重要因素。此外，已有研究[3]表明，糞便細菌受食物的影響很大，如果改變飲食的成份，24 h就可出現(xiàn)完全不一樣的細菌群。而UC是一種慢性反復發(fā)作性的疾病，顯然，僅分析腸道糞便或腸內(nèi)容物的細菌難以反映UC菌群異常的真實情況。因此，找出UC患者穩(wěn)定存在于腸道固生菌群，才能反映UC腸道菌群異常的真實情況。

本實驗以葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導UC模型鼠，選擇前期研究對UC有效的嗜酸乳酸桿菌以不同濃度(104～108/mL)分組治療，并與生理鹽水和激素類藥物比較，計算疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分和結(jié)腸組織損傷評分以驗證其療效，并分析結(jié)腸近、遠端菌群變化情況。IBD雖然病因不明，但已有的研究已證實IBD存在明顯的免疫紊亂，大量動物和臨床研究顯示抗TNFα免疫療法對UC的治療有效，提示TNFα在IBD發(fā)病中起著重要作用，然而從IBD相關的CD4+T細胞亞群的分化情況可以看出，TNFα并非為Th1和Th2細胞主要產(chǎn)生，提示有其它的免疫細胞存在。近來發(fā)現(xiàn)的Th17細胞證實了這個觀點，本實驗進一步分析了Th17/IL-23軸與UC相關的主要細胞因子(TNF-α、IL-23、IL-17)以期有新的發(fā)現(xiàn)，為益生菌治療UC提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：嗜酸乳酸桿菌由本實驗室從正常人腸道自行分離鑒定后采用。

主要試劑：醋酸潑尼松(45 μg/10 g)；DSS(MW 5 000, sigma公司)；抗體：β-actin、IL-17、IL-23、TNF-α(San Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及實驗設計 實驗用Balb/c小鼠56只，雌性，6～8周齡，體重(20.0±2.0)g(購于湖南農(nóng)業(yè)大學)，隨機分成7組，每組8只。分組情況如下：(1)模型組：5%DSS自由飲用；(2)生理鹽水組(Normal saline,NS組)：5%DSS自由飲用+NS(1 mL/10 g)灌胃；(3)A組：5%DSS自由飲用+1×104U/10 g 嗜酸乳酸桿菌灌胃；(4)B組：5% DSS自由飲用+1×106U /10 g 嗜酸乳酸桿菌灌胃；(5)C組:5%DSS自由飲用+1×108U/10 g 嗜酸乳酸桿菌灌胃；(6)醋酸潑尼松組：5%DSS自由飲用+醋酸潑尼松45 μg/10 g)灌胃；(7)正常組：正常飲食。實驗期間觀察小鼠一般情況，計算DAI評分。實驗第7天，乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，于結(jié)腸距回盲部1.0 cm處和肛門1.0 cm處各留取0.5 cm長的結(jié)腸用于細菌分析，另取肛門附近結(jié)腸組織約0.5 cm H&E染色。留取剩余結(jié)腸組織進行PCR及Western blotting檢測。

1.2.2 腸道菌群分析 腸道組織，稱量后勻漿，用NS按梯度稀釋法稀釋，并接種于各非選擇性基及選擇性培養(yǎng)基上，不同細菌的培養(yǎng)基選擇情況見表1。

表1 細菌培養(yǎng)基

細菌鑒定：(1)根據(jù)各菌菌落形態(tài)特征、革蘭染色及光鏡下特征進行初步鑒定；(2)厭氧菌(雙歧桿菌及乳酸桿菌)及腸球菌的進一步鑒定。取培養(yǎng)基上各種形態(tài)的菌落，分離提純后，分別接種于各自適宜的培養(yǎng)基，進一步擴增，厭氧菌置于37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)24 h，需氧菌在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，克隆數(shù)代后，選取外觀及鏡下形態(tài)均一的菌落進行細菌鑒定，應用數(shù)字圖譜判定鑒定結(jié)果。

1.2.3 PCR檢測IL-23、IL-17、TNF-α Quantity One分析軟件測得各產(chǎn)物OD值，以OD測定值/ODβ-actin比值代表基因表達量的相對多少，進行半定量分析 ，引物見表2。

表2 IL-17、IL-23、TNF-α引物

1.2.4 Western-Blotting檢測 IL-23、IL-17、TNF-α蛋白質(zhì)樣本得制備后與一抗結(jié)合反應，抗體稀釋比例為：(1)IL-17、IL-23為 1∶400；(2)TNF-α為1∶2 000；(3)β-actin為1∶5 000。結(jié)果判讀方法同PCR。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組實驗小鼠一般狀態(tài)

實驗小鼠一般狀態(tài)包括小鼠的毛色、精神、食欲及運動狀態(tài)等，結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠的一般狀態(tài)比較

2.2 DAI評分

參考Hamamoto等[4]的方法對小鼠進行DAI評分：A組與模型組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。B組、C組及醋酸潑尼松組DAI評分均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中以B組DAI評分最低。見表4。

2.3 組織損傷評分

參照Dieleman等[5]的評分標準評分。與正常組比較，5%DSS造模后組織損傷評分均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。醋酸潑尼松和各嗜酸乳酸桿菌組小鼠，結(jié)腸組織的損傷評分低于模型組，且B組損傷評分低于醋酸潑尼松組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

2.4 結(jié)腸細菌分析

2.4.1 近端細菌分析 各組細菌在近端結(jié)腸的比較無統(tǒng)計學意義。

2.4.2 遠端細菌比較 各組實驗小鼠結(jié)腸遠端細菌比較結(jié)果見圖1。

表4 各組小鼠DAI評分

*P<0.05，與模型組比較。

表5 各組小鼠組織損傷評分比較

*P<0.05，與正常組比較；#P<0.05，與模型組比較；△P<0.05，與醋酸潑尼松組比較。

2.5 以β-action為參照指標，各組PCR檢測結(jié)果比較

結(jié)果顯示：正常組小鼠結(jié)腸組織IL-23、IL-17、TNF-α mRNA均處于較低水平，模型組為最高；其余依次為NS組、B組、醋酸潑尼松組、C組、A組；其中B組、醋酸潑尼松組、C組、A組與NS組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；綜合上述指標，以B組表達最低，與正常組比較無統(tǒng)計學差異(表6、圖2)。

2.6 以β-action為參照指標，各組Western blotting檢測結(jié)果比較

與PCR檢測結(jié)果類似，以B組IL-23、IL-17、TNF-α的表達最低，與正常組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表7、圖3)。

表6 各組小鼠IL-23、IL-17、TNF-α PCR檢測結(jié)果比較

*P<0.05，與模型組比較；#P<0.05，與NS組比較；△P<0.05，與醋酸潑尼松組比較；▲P<0.05，與正常組比較。

表7 各組小鼠IL-23、IL-17、TNF-α Western blotting檢測結(jié)果比較

*P<0.05，與模型組比較；#P<0.05，與NS組比較；△P<0.05，與醋酸潑尼松組比較；▲P<0.05，與正常組比較。

3 討論

已有大量研究發(fā)現(xiàn)，UC與多種細菌有關[6]。由此，大量動物及臨床試驗關于乳酸桿菌，雙歧桿菌，大腸桿菌等益生菌對UC的治療效果的分析，顯示以上各種細菌對UC均有不同程度的治療作用[7]。在臨床應用益生菌治療UC的實驗觀察中發(fā)現(xiàn)：不同的益生菌制劑以及給藥濃度會導致不同的治療效果，如Gionchetti等發(fā)現(xiàn)高劑量VSL#3對UC患者手術后有較好的恢復和維持效果，但該研究未對益生菌適宜濃度進行分析[8]，是否益生菌濃度越高，其對UC的療效越好尚不得而知。

本研究選擇了前期鑒定并篩選出的嗜酸乳酸桿菌[9]干預UC模型鼠，并分為不同的濃度對比組，通過與NS和醋酸潑尼松比較，對比分析各組UC治療效果。結(jié)果顯示中等濃度的B組小鼠UC癥狀緩解最明顯，DAI評分及組織損傷評分最低，而并非嗜酸乳酸桿菌濃度最高的C組。

為了進一步了解UC癥狀的緩解情況與病變部位的乳酸桿菌濃度的關系，本實驗對小鼠近、遠端結(jié)腸腸道菌群進行分析。由于胃腸道不同區(qū)段粘液中的細菌是不同的，一部分細菌依賴粘液固著生長被命名為“固生菌群”；另一為生活在腸內(nèi)容物中的浮生菌群，隨著糞便排出而消失。由于固生菌群長期定植于腸道，是與UC發(fā)病相關的最終細菌，本實驗選擇用近、遠端結(jié)腸組織用無菌NS清洗、勻漿后接種不同選擇性培養(yǎng)基研究不同濃度嗜酸乳酸桿菌在結(jié)腸不同部位的濃度。結(jié)果顯示各實驗組近端結(jié)腸細菌無明顯差別，遠端結(jié)腸以B組小鼠的益生菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)數(shù)量最多，致病菌(金黃色葡萄球菌)最低。菌群分析結(jié)果與B組療效最佳相符，提示：(1)各組遠端結(jié)腸益生菌與致病菌數(shù)量不同，可能是各組療效不同的原因之一；(2)特定部位定植的乳酸桿菌數(shù)量并非與嗜酸乳酸桿菌濃度完全正相關。由此推測：不同菌株的乳酸桿菌進入腸道后可和其它乳酸桿菌相互促進生長，但當嗜酸乳酸桿菌的濃度達到一定程度后，各種乳酸桿菌之間相互促進作用進入平臺期，反而互相競爭抑制；(3)適量的嗜酸乳酸桿菌可以增加益生菌(雙歧桿菌)的生長，抑制致病菌(金黃色葡萄球菌)生長。

已有的研究已證實IBD存在明顯的免疫紊亂。IL-12與IL-23有相同的亞基p40，研究發(fā)現(xiàn)許多以往認為的與IL-12相關的免疫性疾病均與IL-12和IL-23共有的亞基p40有關[10]。Yen等[11]用IL-10/IL-23p19雙基因缺陷和IL-10/IL-12p35雙基因缺陷小鼠誘導腸道炎癥，發(fā)現(xiàn)IL-23而非IL-12為誘導小鼠腸道炎癥發(fā)生所需。以上研究說明主要是IL-23在UC發(fā)病中起著重要作用。進一步分析IL-23、IL-17、TNF-α的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平顯示：均為模型組最高，NS組次之，醋酸潑尼松組較模型組有明顯降低。結(jié)合小鼠DAI評分及病理組織學評分，提示IL-23、IL-17及TNF-α與UC的嚴重程度呈正相關，嗜酸乳酸桿菌干預組的上述檢測指標均有降低，與小鼠炎癥緩解程度相符。為臨床使用補充益生菌治療UC提供了一定的理論依據(jù)。

[1] Bernstein CN,Shanahan F.Disorders of a modern lifestyle:reconciling the epidemiology of inflammatory bowel diseases[J].Gut,2008,57(9):1185-1191.

[2] Thompson-Chagoyan OC,Maldonado J,Gil A.Aetiology of inflammatory bowel disease (IBD):role of intestinal microbiota and gut-associated lymphoid tissue immune response[J].Clin Nutr,2005,24(3):339-352.

[3] Tremaroli V,Backhed F.Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism[J].Nature,2012，489(7415):242-249.

[4] Hamamoto N,Maemura K,Hirata I,etal.Inhibition of dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis in mice by intracolonically administered antibodies against adhesion molecules (endothelial leucocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1) or intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)) [J].Clin Exp Immunol,1999,117(3):462-468.

[5] Dieleman LA,Palmen MJ,Akol H,etal.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol,1998,114(3):385-391.

[6] Meijer BJ,Dieleman LA.Probiotics in the treatment of human inflammatory bowel diseases:update 2011[J].J Clin Gastroenterol,2011，42(5):2501-2508.

[7] Pace F,Pace M,Quartarone G.Probiotics in digestive diseases:focus on Lactobacillus GG[J].Minerva Gastroenterol Dietol,2015,61(4):273-292.

[8] Gionchetti P,Rizzello F,Morselli C,etal.High-dose probiotics for the treatment of active pouchitis[J].Dis Colon Rectum,2007,50(12):2075-2082.

[9] 楊偉峰,劉凌云,盧放根.益生菌CMS-H002和CMS-H003聯(lián)用對小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2007,23(11):1613-1615.

[10] Hue S,Ahern P,Buonocore S,etal.Interleukin-23 drives innate and T cell-mediated intestinal inflammation[J].J Exp Med,2006,203(11):2473-2483.

[11] Yen D,Cheung J,Scheerens H,etal.IL-23 is essential for T cell-mediated colitis and promotes inflammation via IL-17 and IL-6[J].J Clin Invest,2006,116(5):1310-1306.

(學術編輯：楊健)

本刊網(wǎng)址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統(tǒng)：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

The appropriate concentration of Lactobacillus acidophilus and immunological mechanisms for the treatment of UC

CHEN Lin-lin1,ZHENG Qian2

(DepartmentofGastroenterology,1.XiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011；2.TheFirstPeople’sHospitalofChenzhou,Chenzhou423000,Hunan,China)

Objective：To compare the effect of different concentration of Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus) on ulerative colitis (UC),and to analysis the influenceof of proximal and distal colon of bacteria,to find the appropriate concentration of L.acidophilus for UC,and to explore the immunological mechanism.Methods：56 female Balb/c mice were randomly divided into 7 groups (n=8),dextran sulfate sodium (DSS) made of UC model rats were given different concentration of L.acidophilus, hormones,physiological saline intervention UC model rats,observed the general condition of the mice,calculated the disease activity index (DAI) score,tissue injury score,the intestinal flora of mice was taken for intestinal flora analysis,and PCR and Western-Blotting were used to detect UC related IL-23,IL-17,TNF-α.Results:In the 106CFU/mL concentration group,the UC symptoms relief of the L.acidophilus intervention group were the most obvious,and the number of probiotics (lactobacillus and bifidobacteria) in the distal colon was the most,and the pathogen (staphylococcus aureus) was the lowest.UC related IL-23,IL-17,TNF-α regardless of mRNA level or protein level,were lowest in the L.acidophilus intervention group,especially in the 106U /10 g L.acidophilus gavage group.Conclusion:L.acidophilus UC and its treatment in the distal colon have higher concentrations of lactic acid bacteria,but the result is not completely positive correlation with the concentration of bacteria,inflammatory factor IL-23,IL-17 and TNF-α are positively correlated with the UC disease severity,associate with the therapeutic effect of L.acidophilus on UC.

Lactobacillus acidophilus;Flora analysis;Experimental colitis;Immunological mechanism;Interleukin 23;Interleukin 17

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.007

國家自然科學基金青年科學基金項目(8160042)

2017-01-12

陳琳琳(1982-)，女，博士，主治醫(yī)生。E-mail：35398784@qq.com

時間：2017-6-21 18∶09 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.014.html

R

A