筋骨草水煎液對(duì)急性肺炎的保護(hù)作用研究

唐潔，呂云瑤，龍之浩，羅新，張建軍，張姍，蔡曉明

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

筋骨草水煎液對(duì)急性肺炎的保護(hù)作用研究

唐潔1，呂云瑤2，龍之浩2，羅新2，張建軍2，張姍2，蔡曉明3

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

目的：研究筋骨草水煎液對(duì)小鼠急性肺炎的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：用LPS吸入法建立急性肺炎模型，設(shè)空白對(duì)照組、模型組、筋骨草水煎液組和地塞米松組。觀察小鼠肺組織病理,測定肺指數(shù)、肺濕/干比，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β的含量。結(jié)果：筋骨草組與模型組比較減輕了急性肺炎小鼠肺組織病變，數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件分析，小鼠肺指數(shù)、肺濕干比明顯降低，差異顯著(P<0.05)，降低肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β的含量，差異顯著(P<0.05)。結(jié)論：筋骨草水煎液有一定的抗炎作用，可以緩解小鼠急性肺炎癥狀，其機(jī)制可能與降低TNF-α、IL-1β的含量有關(guān)。

筋骨草；急性肺炎；保護(hù)作用

急性肺炎與感染后失控的炎癥反應(yīng)有關(guān)，能引起機(jī)體多器官功能障礙[1]。急性肺炎的發(fā)病機(jī)制、致病過程復(fù)雜，發(fā)展迅速、預(yù)后極差。據(jù)報(bào)道，急性肺炎的發(fā)病率逐年增加，其死亡率高達(dá)40%～60%[2]，臨床上主要應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素類、解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物進(jìn)行治療[3]，而以上藥物持續(xù)或大量應(yīng)用會(huì)引起許多不良反應(yīng)，相對(duì)而言，來自天然的中藥品種繁多、選擇性大，同時(shí)毒副反應(yīng)少、大多安全有效，具有化學(xué)合成藥不可替代的優(yōu)勢。因此，中藥的研究逐漸吸引了人們的目光。筋骨草又名白毛夏枯草、金瘡小草、透筋草等，來源于唇形科植物Ajuga decumbens Thumb的全草，主要分布于我國秦嶺以南各省區(qū)。筋骨草性寒、味苦，歸肺經(jīng)，有清熱解毒、涼血消腫之效，主治咽喉腫痛、肺熱咯血、跌打損傷等。研究發(fā)現(xiàn)筋骨草具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化、抗腫瘤等藥理作用，臨床應(yīng)用于慢性支氣管炎、慢性腎小球腎炎、肝炎等疾病[4]。結(jié)合筋骨草的歸經(jīng)特點(diǎn)及藥理作用，本研究在探索急性肺炎的治療方法中具有可行性及現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)這項(xiàng)研究可以為臨床應(yīng)用筋骨草提供實(shí)用準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，從而為我國廣袤的筋骨草資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

筋骨草水煎液(取四川產(chǎn)筋骨草全草切碎、洗凈，浸泡30 min，煎煮至沸后調(diào)至文火，繼續(xù)煎煮15～20 min，同法煎煮兩次，合并煎煮液，濃縮至需用濃度)。試驗(yàn)鼠為KM雄性小鼠，7周齡，體重35～40 g。由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK(川)2013—076。屏障環(huán)境飼養(yǎng)。LPS購自美國Sigma公司(用pH 7.4、10 mmol/L的PBS稀釋成合適濃度，分裝于玻璃瓶中，-20 ℃保存?zhèn)溆?，小鼠血清TNF-α試劑盒，IL-1β試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司，地塞米松磷酸鈉注射液購于成都第一藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)分組與給藥

將 KM 小鼠 72只隨機(jī)分為 6組：(1)空白對(duì)照組(12只)；(2)模型組(12只)；(3)筋骨草水煎液低(4 g/kg，12只)、中(8 g/kg，12只)、高劑量(12 g/kg，12只)組；(4)地塞米松組(2 mg/kg，12只)。于造模前1周起，中藥組小鼠每天定時(shí)灌胃給藥1次，模型組和空白對(duì)照組灌服生理鹽水(10 mL/kg)；西藥組于造模前1 h腹腔注射給藥。

1.3 急性肺炎模型建立

小鼠垂直固定，用移液槍吸取5 mg/mL LPS溶液80 μL，分3次滴鼻，待液體全部經(jīng)鼻吸入后，以適宜力度左右搖晃數(shù)次，使其能均勻感染肺部，放于籠中讓其自然蘇醒[5],同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,以等量的pH7.4、10 mmol/L PBS 80 μL分3次滴鼻，滴鼻后處理方法同前。

1.4 肺組織LI、W/D測定及其病理組織學(xué)檢查

小鼠造模24 h后脫頸處死(殺剖前禁食禁水4 h)，沿腹中線剪開直至氣管，充分暴露胸腔，接著用鑷子取出整個(gè)肺，用生理鹽水將肺組織清洗干凈后用濾紙輕輕吸干水分，稱出肺濕重，計(jì)算LI(LI=小鼠肺濕重/小鼠體重)。稱量右肺濕重后置于80 ℃烤箱至恒重，稱量肺干重，計(jì)算W/D，判斷肺的水腫程度。左肺用10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后觀察肺組織病變情況。

1.5 ELISA測定肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β

造模后4 h，在無菌條件下處死小鼠，氣管插管后注入滅菌生理鹽水，分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，每次注入0.4 mL，灌洗后反復(fù)抽吸兩次，隨即注入無菌EP管中，每只小鼠BALF的回收率應(yīng)大于85%，將收集的灌洗液于3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液,標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存，按照試劑盒說明書操作，測定TNF-α、IL-1β。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理變化

空白對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)正常；模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肺泡毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，大量炎癥細(xì)胞浸潤肺部，肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡腔內(nèi)有成片水腫液；筋骨草組病變較模型組有所改善，高劑量組與地塞米松組上述變化明顯減輕，僅見肺泡毛細(xì)血管輕度充血擴(kuò)張，少量炎癥細(xì)胞浸潤和局灶性肺泡間隔增厚，結(jié)果如圖1所示。

2.2 LI和W/D

與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠LI,W/D顯著升高(P<0.05)，表明急性肺炎造模成功；和模型組相比，地塞米松組LI,W/D顯著降低(P<0.05)；和模型組相比，筋骨草組LI,W/D顯著降低(P<0.05)，其中高劑量組效果更顯著(P<0.05)，說明筋骨草對(duì)肺炎的保護(hù)作用呈劑量依賴性，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠肺濕干比、肺指數(shù)比較

*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05，與模型組比較；△P<0.05，與筋骨草高劑量組比較。

2.3 小鼠BALF中炎癥因子表達(dá)的變化

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠TNF-α、IL-1β的含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；和模型組相比，地塞米松組TNF-α、IL-1β的含量顯著降低(P<0.05)；和模型組相比，筋骨草組TNF-α、IL-1β的含量顯著降低(P<0.05)，說明筋骨草在一定程度上抑制TNF-α、IL-1β的分泌，其中高劑量組效果更顯著(P<0.05),結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β比較

*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05，與模型組比較；△P<0.05，與筋骨草高劑量組比較。

3 討論

臨床數(shù)據(jù)分析表明，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生急性肺炎的原因有很多，其中LPS(脂多糖)是引發(fā)急性肺炎并導(dǎo)致死亡的主要原因之一，LPS作為內(nèi)毒素的主要成分，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層的一層較厚的類脂多糖類物質(zhì)，它會(huì)引起機(jī)體支氣管炎、肺炎、肝炎及脂多糖血癥等[6]。炎癥過程中釋放的多種炎癥因子共同作用，從而導(dǎo)致多器官的損害，其中TNF-α、IL-1β作用于多種細(xì)胞，激發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]。本實(shí)驗(yàn)急性肺炎造模是利用小鼠自然呼吸時(shí)經(jīng)鼻滴入一定量的LPS，從而保證LPS在肺內(nèi)分布均勻，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模型組的炎癥程度均高于空白組，表明急性肺炎模型復(fù)制成功。

與模型組及筋骨草各組比較，地塞米松組LI、W/D、TNF-α、IL-1β均顯著降低(P<0.01)，說明地塞米松對(duì)急性肺炎早期防治有顯著療效，一方面腹腔注射給藥的方式使其能充分迅速地發(fā)揮療效，另一方面可能與其影響NF-κB通路，減少COX-2、促炎介質(zhì)的合成有關(guān)[8]。地塞米松是一種人工合成的長效糖皮質(zhì)激素，藥理作用為抗炎、抗風(fēng)濕、抗毒素、抗過敏、抗休克及免疫抑制等，主要用于治療過敏性與自身免疫性炎癥疾病，如嚴(yán)重的支氣管哮喘，皮炎等過敏性疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，急性白血病，惡性淋巴瘤等，目前臨床上應(yīng)用仍廣泛，本研究中各項(xiàng)指標(biāo)說明地塞米松對(duì)急性肺炎早期防治有顯著療效，地塞米松作為陽性對(duì)照藥物，在抗炎藥物開發(fā)中具有常見性[9]。

中醫(yī)藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，中醫(yī)中藥從整體出發(fā)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡[10]，尤其在復(fù)方中藥治療復(fù)雜疾病的過程中，其機(jī)制可能是通過多成分、多途徑和多靶點(diǎn)的作用達(dá)到單一靶點(diǎn)的化學(xué)合成藥物難達(dá)到的效果。已有研究表明筋骨草的有效成分主要包括黃酮類、二萜類、環(huán)烯醚萜類、植物蛻皮甾酮類、糖苷等，這些物質(zhì)已從筋骨草中提取分離，并進(jìn)一步對(duì)其含量和藥理作用進(jìn)行了詳細(xì)準(zhǔn)確的分析[11-13]。

本研究基于筋骨草臨床應(yīng)用和科學(xué)研究，采用傳統(tǒng)水提法制備一定濃度的水煎液，對(duì)急性肺炎早期治防治進(jìn)行系統(tǒng)的觀察研究,方差分析表明與模型組比較，筋骨草組LI、W/D、TNF-α、IL-1β均顯著降低(P<0.05)，說明筋骨草水煎液能夠抑制急性肺炎的發(fā)展過程，對(duì)急性肺炎有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與影響NF-κB通路，抑制炎癥因子的分泌有關(guān)，同時(shí)筋骨草組內(nèi)比較各項(xiàng)指標(biāo)均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，為筋骨草進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療急性肺炎提供了理論依據(jù)。

由于筋骨草水煎液成分復(fù)雜且臨床應(yīng)用受限，具體是那種或哪些成分發(fā)揮了抗炎作用，目前尚無定論，因此確定哪一種單體在其中發(fā)揮主要作用具有實(shí)際意義。乙酰哈巴苷作為從筋骨草中提取的主要有效成分,《藥典》記載：筋骨草中乙酰哈巴苷(C17H26O11)的含量不小于0.40%。作為筋骨草重要成分的乙酰哈巴苷，可能發(fā)揮了重要作用，有待進(jìn)一步研究。

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(學(xué)術(shù)編輯：李萇清)

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Study on protective effect of water decotion of Ajuga decumbens on acute lung inflammation in mice

TANG Jie1,LV Yun-yao2,LONG Zhi-hao2,LUO Xin2,ZHANG Jian-jun2,ZHANG Shan2，CAI Xiao-ming3

(1.SchoolofPharmacy;2.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine;3.SchoolofBasicMedicalSciences,NorthSichuanMeicalcollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To study the protective effects of aqueous extract of Ajuga decumbens on acute lung inflammation induced by lipopolysaccharide(LPS) and the molecular mechanism of protection in mice.Methods：Models of acute lung inflammation were established by inhalation of LPS,mice were randomly divided into control group,model group,Ajuga decumbens group and dexamethasone group.Pathological changes in lung tissues of mice were observed,lung index(LI) and lung dry weight and wet weight ratio(W/D) were detected,TNF-α、IL-1β in BALF were measured by ELISA method.Results:The different concentration of aqueous extract of Ajuga decumbens could decrease pathological changes of lung tissues in acute lung inflammation mice compared with the model group.The data was analysis by SPSS13.0 software,LI,W/D and the content of TNF-α,IL-1β in BALF were significantly decreased,there were obvious differences(P<0.05).Conclusion:The aqueous extract of Ajuga decumbens has definite anti-inflammatory effect,can alleviate the symptoms of acute pneumonia in mice,and its mechanism may be related to the reduction of TNF-α and IL-1β content.

Ajuga decumbens；Acute lung inflammation；Protective effect

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.004

四川省教育廳項(xiàng)目(12ZA190)；四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(130283)

2016-09-17

唐潔(1990-)，女，碩士。E-mail：402775653@qq.com

時(shí)間：2017-6-21 18∶09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.008.html

1005-3697(2017)03-0329-03

R563.1

A