肝外膽管癌癌組織ADAM 17、MMPs表達(dá)情況與患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系分析

葉發(fā)鈞，張 平

（什邡市人民醫(yī)院肝膽外科，什邡 618400）

肝外膽管癌癌組織ADAM 17、MMPs表達(dá)情況與患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系分析

葉發(fā)鈞，張 平

（什邡市人民醫(yī)院肝膽外科，什邡 618400）

目的：分析肝外膽管癌癌組織去整合素-金屬蛋白酶17（ADAM17）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)情況及其與患者手術(shù)預(yù)后的關(guān)系。方法： 回顧性分析我院收治的80例肝外膽管癌患者的臨床資料，所有患者術(shù)中均留取癌組織，采用免疫組化法測(cè)定ADAM17、MMPs表達(dá)，分析肝外膽管癌癌組織ADAM17、MMPs表達(dá)與其手術(shù)預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果： ①肝外膽管癌患者癌組織ADAM17、MMP-3、MMP-9高表達(dá)所占比例均高于癌旁組織；②肝外膽管癌患者術(shù)后3年、5年生存率為33.75%、22.50%，單因素分析證實(shí)：膽管癌位置、腫瘤直徑、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管及神經(jīng)侵犯、切緣狀態(tài)、ADAM17表達(dá)、MMP-3表達(dá)、MMP-9表達(dá)均與患者預(yù)后有關(guān)；③COX多因素分析證實(shí)，組織學(xué)分級(jí)、切緣狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ADAM17表達(dá)、MMP-3表達(dá)、MMP-9表達(dá)均為影響肝外膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論： ADAM17、MMP-3、MMP-9高表達(dá)均為影響肝外膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其表達(dá)水平的變化與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥浸潤(rùn)有密切關(guān)聯(lián)。

肝管癌；ADAM17；MMPs；預(yù)后

肝外膽管癌是指發(fā)于肝外膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤類型，包括肝門部及遠(yuǎn)端膽管癌，近年來(lái)其發(fā)病率有所上升［1］。肝外膽管癌患者發(fā)病早期患者多無(wú)特異性癥狀及體征，就診時(shí)大多數(shù)已處于進(jìn)展期，或出現(xiàn)周圍器官侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等表現(xiàn)，預(yù)后通常較差。手術(shù)是目前治療肝外膽管癌的主要手段，但肝外膽管癌患者其腫瘤灶沿膽管壁浸潤(rùn)生長(zhǎng)，導(dǎo)致肝外膽管手術(shù)切緣陰性率低，根除率差。研究［2］認(rèn)為，膽管癌侵襲浸潤(rùn)程度、切緣狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化等因素均與肝外膽管癌手術(shù)預(yù)后密切關(guān)聯(lián)。近期也有報(bào)道［3］表示，去整合素-金屬蛋白酶17（ADAM17）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）異常表達(dá)均為影響多類腫瘤患者預(yù)后的相關(guān)因素，其表示ADAM 17與患者腫瘤侵襲情況有關(guān)，同時(shí)腫瘤侵襲過(guò)程為癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）互相作用的過(guò)程，該過(guò)程中降解酶類、細(xì)胞粘附分子等均發(fā)揮重要的作用，尤其癌細(xì)胞所分泌的MMPs可降解ECM，引起基底膜受損，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)，造成腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。基于此，為探討肝外膽管癌患者癌組織ADAM17、MMPs表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系，我院對(duì)收治的80例患者的臨床資料展開了回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 臨床資料

1.1 一般資料收集2008年1月～2011年5月于我院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為肝外膽管癌的80例患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)病理確診為肝外膽管癌，未合并遠(yuǎn)處器官、組織轉(zhuǎn)移；術(shù)中均留取膽管癌組織標(biāo)本；有完整臨床及隨訪資料；術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：圍術(shù)期死亡者；臨床資料不完整者；合并嚴(yán)重心肝腎肺疾病及精神疾病者；合并其他惡性腫瘤者。其中男56例，女24例；年齡28～82歲，平均（61.5± 3.7）歲；其中肝門膽管癌38例，遠(yuǎn)端膽管癌42例；腫瘤直徑1～5cm，平均（3.2±0.4）cm；腫瘤侵犯神經(jīng)37例，侵犯血管26例；腫瘤TNM分期：T1+T2期37例，T3+T4期43例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。

1.2 方法選擇手術(shù)切除肝外膽管癌患者病理蠟塊組織，包括癌組織、癌與正常組織交界（癌旁組織30例）標(biāo)本，每份標(biāo)本連續(xù)切片4μm共4張，1張作常規(guī)HE染色，剩余3張用于免疫組化染色，試劑包括：兔抗人ADAM17多克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)OriGene公司），兔抗人MMP-3、MMP-9多克隆抗體（均購(gòu)自美國(guó)CST公司），免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自武漢博士德公司。MMP-3、MMP-9、ADAM17檢測(cè)均采用免疫組化法，應(yīng)用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）法，切片脫蠟，水化，PBS洗滌3次，5min/次，雙氧水室溫浸泡0.5h，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)，滴加兔抗人MMP-3、MMP-9多克隆抗體，兔抗人ADAM17多克隆抗體，免疫組化染色參照試劑使用說(shuō)明操作，對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)作半定量分析，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 染色結(jié)果判定ADAM17、MMP-9、MMP-3均以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性，定位細(xì)胞質(zhì)，ADAM17表達(dá)水平為腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞染色比例與染色強(qiáng)度的乘積，染色比例評(píng)分包括0分（陽(yáng)性細(xì)胞≤5%）、1分（陽(yáng)性細(xì)胞6%～25%）、2分（陽(yáng)性細(xì)胞26%～50%）、3分（陽(yáng)性細(xì)胞≥51%）；染色強(qiáng)度包括0分（無(wú)色）、1分（弱陽(yáng)性，淡黃色）、2分（陽(yáng)性，黃色）、3分（強(qiáng)陽(yáng)性，棕黃色）。評(píng)分≤3分為低表達(dá)，評(píng)分＞3分為高表達(dá)。

1.3.2 預(yù)后觀察所有患者術(shù)后均完成12～62個(gè)月隨訪調(diào)查，平均隨訪時(shí)間為（48.5±6.4）個(gè)月，隨訪終點(diǎn)為2016年5月。以門診、電話、上門隨訪及門診復(fù)查的形式，對(duì)患者術(shù)后癥狀、生存狀態(tài)、生化檢查結(jié)果進(jìn)行隨訪，隨訪終止時(shí)間為發(fā)生事件或病人因疾病死亡或隨訪截止日，統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后3年、5年生存率，分析ADAM 17、MMP-3、MMP-9異常表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用COX回歸分析作預(yù)后多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝外膽管癌癌組織、癌旁組織ADAM 17、MMP-3、MMP-9表達(dá)情況肝外膽管癌患者癌組織ADAM17、MMP-3、MMP-9高表達(dá)所占比例均高于癌旁組織（P<0.05），見表1。

表1 肝外膽管癌癌組織、癌旁組織ADAM 17、MMP-3、MMP-9表達(dá)情況 ［n（%）］

2.2 肝外膽管癌患者臨床病理因素及ADAM 17、MM P-3、MM P-9表達(dá)情況與預(yù)后關(guān)系80例肝外膽管癌患者術(shù)后3年、5年生存率為33.75%（27/80）、22.50%（18/80）。性別、年齡與患者術(shù)后3年、5年生存率無(wú)明顯相關(guān)性，遠(yuǎn)端膽管癌、腫瘤直徑＜3cm、高中分化、T1+T2分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)血管及神經(jīng)侵犯、切緣陰性、ADAM17低表達(dá)、MMP-3低表達(dá)、MMP-9低表達(dá)患者術(shù)后3年、5年生存率較高（P<0.05），見表2。

表2 肝外膽管癌患者臨床病理因素及ADAM 17、MMP-3、MMP-9表達(dá)情況與預(yù)后關(guān)系

2.3 影響肝外膽管癌患者預(yù)后COX多因素分析COX多因素分析證實(shí)，組織學(xué)分級(jí)、切緣、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ADAM17表達(dá)、MMP-3表達(dá)、MMP-9表達(dá)均為影響肝外膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），見表3。

表3 影響肝外膽管癌患者預(yù)后COX多因素分析

3 討論

肝外膽管癌系臨床少見但非罕見高度惡性腫瘤類型，患者預(yù)后較差。以往多認(rèn)為［4］切緣狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤侵犯等病理因素是影響肝外膽管癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。近期有報(bào)道［5］發(fā)現(xiàn)，有相同病理特征且實(shí)施相同手術(shù)方式的肝外膽管癌患者其術(shù)后總生存時(shí)間有其差異，該觀點(diǎn)提出肝外膽管癌患者預(yù)后不僅受到腫瘤病理學(xué)參數(shù)及手術(shù)方式的影響，同時(shí)與腫瘤生物學(xué)行為有其關(guān)聯(lián)。

ADAM17早期被認(rèn)為是影響多種惡性腫瘤獨(dú)立預(yù)后的相關(guān)因素［6］，其為去整合素-金屬蛋白酶蛋白家族成員，屬膜錨定金屬蛋白酶，參與多類膜相關(guān)蛋白的水解過(guò)程，在腫瘤微環(huán)境中，ADAM17在調(diào)節(jié)多種表皮生長(zhǎng)因子受體、配體中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是調(diào)節(jié)腫瘤表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）活性的關(guān)鍵蛋白酶，而EGRF受體激活則是誘導(dǎo)惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的主要原因［7］。趙廷寬等［8］研究發(fā)現(xiàn)，肝外膽管癌患者EGFR表達(dá)陽(yáng)性者其整體生存率明顯低于陰性表達(dá)者。同時(shí)報(bào)道［9］顯示，在非小細(xì)胞肺癌、胃癌、腎癌、乳腺癌等患者中，ADAM17基因及蛋白的表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度均有密切關(guān)聯(lián)，且其表示，ADAM17高表達(dá)水平患者其預(yù)后水平差，遠(yuǎn)期生存率低。本研究發(fā)現(xiàn)，肝外膽管癌患者癌組織ADAM17高表達(dá)所占比例較高，明顯高于癌旁組織，與張同軍等［10］報(bào)道相符。且單因素分析發(fā)現(xiàn)，ADAM17高表達(dá)患者3年、5年生存率低于低表達(dá)者，COX回歸分析表明，ADAM17表達(dá)為影響肝外膽管癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述報(bào)道結(jié)論相符。

MMPs則為關(guān)鍵的蛋白水解酶家族，歸于鋅離子依賴性蛋白酶范疇，可降解細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜成分，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解重塑，可促進(jìn)惡性腫瘤微環(huán)境形成，在腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展過(guò)程中有重要作用［11］。MMPs包括明膠酶、膜型-MMPs、間質(zhì)膠原酶、間質(zhì)溶素等亞型，每類MMPs均有相似的氨基酶序列，其表達(dá)及活性受到酶原活化、合成及其抑制劑的影響，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及粘附因子等活性介導(dǎo)是酶原合成的重要調(diào)節(jié)因素，纖溶酶系統(tǒng)則為MMPs活化的關(guān)鍵激活因子，其活性受內(nèi)源性抑制劑影響，與侵襲及轉(zhuǎn)移表型有正相關(guān)聯(lián)系［12］。目前MMPs與腫瘤侵襲的相關(guān)性已得到細(xì)胞學(xué)研究者證實(shí)，研究［13］發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)MMPs表達(dá)活性顯著高于附近正常組織。MMP-9則為Ⅳ型膠原酶，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，可降解Ⅳ型膠原，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。彭劍波等［14］表示，MMP-9高表達(dá)與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有其密切關(guān)聯(lián)。MMP-3則為間質(zhì)溶解素，與炎癥因子激活有緊密聯(lián)系，巨噬細(xì)胞、成纖細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、EGFR、腫瘤壞死因子等激活或活化后，均可上調(diào)MMP-3表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝外膽管癌患者癌組織中MMP-9、MMP-3表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與Prakobwong S等［15］報(bào)道相符。同時(shí)單因素、多因素分析均證實(shí)，MMP-9、MMP-3高表達(dá)與肝外膽管癌患者預(yù)后有明顯相關(guān)性，可能與MMPs表達(dá)強(qiáng)化可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，癌細(xì)胞分泌MMPs后可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致膽管癌浸潤(rùn)，影響患者預(yù)后。

綜上所述，除臨床相關(guān)病理因素外，ADAM 17、MMP-3、MMP-9均為影響肝外膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ADAM17、MMP-3、MMP-9均與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥浸潤(rùn)有緊密聯(lián)系，可將其作為肝外膽管癌患者抗癌治療的新靶點(diǎn)、新方向。

［1］ 譚勇, 邱寶安, 孟宇宏, 等. 去整合素-金屬蛋白酶17過(guò)度表達(dá)對(duì)肝外膽管癌手術(shù)患者的預(yù)后價(jià)值［J］. 中華肝膽外科雜志, 2015, 21(10): 674-677.

［2］ Namwat N, Puetkasichonpasutha J, Loilome W, et al. Downregulation of reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) is associated with enhanced expression of matrix metalloproteinases and cholangiocarcinoma metastases ［J］. Journal of gastroenterology, 2011, 46(5): 664-675.

［3］ 姚旭, 劉源, 王勇, 等. Gab1與MMP-9在膽管癌中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2013, 21(1): 118-121.

［4］ 解芳, 劉鴻梅. 血清和膽汁 MMP-9、TIMP-1檢測(cè)在膽管癌診斷中的價(jià)值［J］. 山東醫(yī)藥, 2016, 56(25): 56-58.

［5］ G P Xiong, J X Zhang, S P Gu, et al. Overexpression of ECM1 Contributes to Migration and Invasion in Cholangiocarcinoma Cell［J］. Neoplasma: Journal of Experimental and Clinical Oncology, 2012, 59(4): 409-415.

［6］ 劉俊. Fascin、MMP-9與膽管癌的相關(guān)性研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)現(xiàn)代手術(shù)學(xué)雜志, 2011, 15(2): 156-159.

［7］ 朱林生, 王勇, 常桂芝, 等. 肝外膽管癌CD44v6、MMP-2的表達(dá)及意義［J］. 河北醫(yī)藥, 2011, 33(19): 2936-2938.

［8］ 趙廷寬, 李春燕, 楊勇, 等. 生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2、基質(zhì)金屬蛋白酶3和9在膽管癌中的表達(dá)及其意義［J］. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(7): 1099-1102.

［9］ 王曉茜, 唐南洪, 李秀金, 等. 穿膜蛋白1和基質(zhì)金屬蛋白酶9在膽管癌中的表達(dá)及意義［J］. 臨床肝膽病雜志, 2014, 30(3): 260-263.

［10］ 張同軍, 薛棟, 曲國(guó)香, 等. 滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2與MMP-9在膽管癌中的表達(dá)和臨床意義［J］. 國(guó)際外科學(xué)雜志, 2015, 42(2): 101-105.

［11］ 霍華英. 基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)及巨噬細(xì)胞含量在膽管癌中的病理學(xué)意義［J］. 山西醫(yī)藥雜志, 2012, 41(3): 235-236.

［12］ 周賢, 田誠(chéng), 孫權(quán), 等. 解整合素金屬蛋白酶9在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2012, 29(7): 1334.

［13］ Wang Q, Tang H, Yin S, et al. Downregulation of microRNA-138 enhances the proliferation, migrationand invasion of cholangiocarcinoma cells through the upregulation of RhoC/p-ERK/MMP-2/MMP-9［J］. Oncology reports, 2013, 29(5): 2046-2052.

［14］ 彭劍波, 舒國(guó)順, 劉海軍, 等. RUNX3在人膽管癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］. 醫(yī)學(xué)臨床研究, 2012, 29(12): 2330-2332.

［15］ Prakobwong S, Charoensuk L, Hiraku Y, et al. Plasma hydroxyproline, MMP-7 and collagen i as novel predictive risk markers of hepatobiliary disease-associated cholangiocarcinoma［J］. International Journal of Cancer =: Journal International du Cancer, 2012, 131(4): E416-E424.

An analysis of the relationship between expression of ADAM 17 and MMPs in extrahepatic cholangiocarcinoma tissues and the prognosis

Ye Fa-jun , Zhang Ping
(Department of Hepatobiliary Surgery, People’s Hospital of Shifang, Shifang 618400, China)

Objective To analyzed the expression of disintegrin-metalloproteinase 17(ADAM17) and matrix metalloproteinases (MMPs) in extrahepatic cholangiocarcinoma tissues and its relationship with the prognosis. M ethods The clinical data of 80 patients with extrahepatic cholangiocarcinoma in our hospital were retrospectively analyzed. The cancer tissues of all patients were collected. The expression of ADAM17 and MMPs was determined by immunohistochemistry. The correlation between the expression of ADAM17 and MMPs in extrahepatic cholangiocarcinoma tissues and the prognosis was analyzed. Results ①The percentages of high expression of ADAM17, MMP-3 and MMP-9 in cancer tissues of patients with extrahepatic cholangiocarcinoma were higher than those in adjacent tissues; ②The 3-year and 5-year survival rates of patients with extrahepatic cholangiocarcinoma were 33.75% and 22.50%, respectively. Univariate analysis showed that the location of cholangiocarcinoma, diameter of tumor, differentiation degree, T stage, lymph node metastasis, vascular and nerve invasion, status of incisal margin, expression of ADAM17, MMP-3 and MMP-9 were correlated with the prognosis of the patients; ③COX multivariate analysis showed that histological grade, status of incisal margin, lymph node metastasis, expression of ADAM17, MMP-3 and MMP-9 were independent risk factors for the prognosis of patients with extrahepatic cholangiocarcinoma. Conclusion The high expression of ADAM17, MMP-3 and MMP-9 are the independent risk factors for the prognosis of patients with extrahepatic cholangiocarcinoma, and the changes of expression levels are closely related to the invasion, metastasis and inflammatory infiltration of tumors.

extrahepatic cholangiocarcinoma; ADAM17; MMPs; prognosis

R735.8

A

1673-016X（2017）03-0128-05

2017-02-08

葉發(fā)鈞，E-mail: 20566475@qq.com