m iRNA221對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響

莫鴻英，李玉飛

（1.長沙市婦幼保健院婦產(chǎn)科，長沙 410007；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410006）

m iRNA221對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響

莫鴻英1，李玉飛2

（1.長沙市婦幼保健院婦產(chǎn)科，長沙 410007；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410006）

目的：探討干擾miRNA221對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為Siha，Siha-模擬物即（siha-mimic），陰性對(duì)照Siha-nc（mimic），Siha-抑制劑即（Siha-inhibitor），陰性對(duì)照Siha-nc（inhibitor）五組。采用qPCR、Western blotting、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA221在宮頸癌siha細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果：在siha-mimic組，miRNA221表達(dá)明顯高于Siha組和Siha-nc（mimic）組，E-鈣粘素（E-cadherin，E-cad）表達(dá)水平明顯降低，N-鈣粘素（N-cadherin，N-cad）及波形蛋白（Vimentin）蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；在Siha-inhibitor組，miRNA221表達(dá)明顯低于Siha組和Siha-nv（inhibitor）組，E-cad蛋白表達(dá)水平明顯升高，N-cad和Vimentin表達(dá)水平顯著下調(diào)。結(jié)論：干擾miRNA221抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

宮頸癌；miRNA221；侵襲轉(zhuǎn)移；E-鈣粘素；N-鈣粘素

宮頸癌是婦女生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居?jì)D科惡性腫瘤第2位，宮頸癌治療的難點(diǎn)是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［1］。因此，找到宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記和靶點(diǎn)，則有望為早期診斷及治療宮頸癌提供理論依據(jù)。miRNA是一類長度為18-23個(gè)核苷酸的單鏈非編碼微小RNA，其穩(wěn)定性高度遺傳，主要通過其下游靶基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。miRNA221在相關(guān)腫瘤（乳腺癌，直腸癌，卵巢癌）的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用［3，4］，但是在宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演如何的作用，目前尚不清楚。因此，本研究擬在宮頸癌細(xì)胞株Siha觀察miRNA221對(duì)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響。

1 資料與方法

1.1 宮頸癌細(xì)胞株siha購自美國ATCC公司。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購杭州四季青公司，二甲基亞砜DMSO凍存液購自美國sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)公司，miRNAmimic及inhibitor購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，E-cad，N-cad及Vimentin抗體購自epitomics。

1.3 方法實(shí)驗(yàn)分為Siha，Siha- m im ic（m im ic即m iRNA 221模擬物），陰性對(duì)照組Siha-nc（m im ic），Siha- inhibitor（inhibitor即miRNA221抑制劑），陰性對(duì)照組Siha-nc（inhibitor）五組。Siha-nc（mimic）組為采用m iRNA221模擬物處理Siha的陰性對(duì)照，Sihanc（miRNA221抑制劑）組為采用miRNA221抑制劑處理Siha的陰性對(duì)照，Siha- m iRNA221模擬物組采用miRNA221模擬物處理Siha細(xì)胞株，Siha- miRNA221抑制劑組采用miRNA221抑制劑處理Siha細(xì)胞株。

1.3.1 熒光定量PCR利用Trizol法從宮頸癌細(xì)胞株siha中提取總RNA，測量濃度計(jì)純度，按照公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行定量PCR測定。

1.3.2 細(xì)胞蛋白樣品的制備培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞經(jīng)過裂解，離心。取上清。采用BCA 法測定蛋白濃度。加入5×SDS加樣緩沖液，95℃變性4 min 后，-30℃保存。

1.3.3 蛋白濃度測定采用碧云天公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行。樣品制備完畢后采用酶標(biāo)儀測定，其測定波長540-595nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.3.4 W estern b lotting分別配置10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，樣品于 100 ℃變性3 min。各孔均上樣品 50 μg，恒壓80 V，15 min濃縮。再恒壓100V，電泳約100min。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。封閉1 h。一抗孵育。二抗孵育。經(jīng)過雜交后，放置發(fā)光儀，顯影。

1.3.5 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，感染前一天將目的細(xì)胞分入6-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，用于后續(xù)熒光定量PCR及westernblotting實(shí)驗(yàn)用。按照miRNA221mimic及inhibitor試劑說明書稀釋干粉，為轉(zhuǎn)染做好準(zhǔn)備。感染實(shí)驗(yàn)相應(yīng)組別加入慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)。之后培養(yǎng)24-72h收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)按照事先實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組別，在孔中加入約3X104個(gè)感染后的細(xì)胞。第二天上午換低濃度血清培養(yǎng)基，將劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的下端中央部位，朝上輕推劃痕。用無血清培養(yǎng)基漂洗2遍，再加入低濃度血清培養(yǎng)基，拍照0h。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～24h，取出后用熒光顯微鏡拍照。

1.3.7 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)溶膠，之后用冷無血清McCoy’s 5A稀釋Matrigel膠（1：3稀釋）；接種培養(yǎng)細(xì)胞，孵育48小時(shí)；4%多聚甲醛固定tranwell小室30～40min，0.1%結(jié)晶紫700m lμl染色tranwell小室30min，隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean± SEM）表示，符合正態(tài)分布，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，各組間差異采用單因素方差one-way ANOVA分析，方差分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多重比較采用LSD法。P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 干擾m iRNA221的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子E-cad，N-cad，VimentinmRNA表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染miRNA221的mimic和inhibitor干擾miRNA221表達(dá)后，檢測EMT相應(yīng)指標(biāo)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Siha以及陰性對(duì)照Siha-nc（m）組比較，轉(zhuǎn)染mimic組E-cad表達(dá)下調(diào)顯著，N-cad及Vimentin表達(dá)顯著上調(diào)；與Siha以及陰性對(duì)照Siha-nc（i）組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor組E-cad表達(dá)上調(diào)顯著，N-cad及Vimentin表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.08，P<0.01；F=27.03，P<0.01；F=17.02，P<0.01）（圖1，表1）。這表明miRNA可以使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖1 熒光定量PCR檢測干擾miRNA221表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響

表1 熒光定量PCR檢測干擾miRNA221表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響

2.2 干擾m iRNA 221的表達(dá)對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞株蛋白E-cad，N-cad，Vim entin的影響為了檢測轉(zhuǎn)染miRNA221的mimic和inhibitor后，EMT相關(guān)蛋白E-cad，N-cad和Vimetin表達(dá)變化，本實(shí)驗(yàn)通過western blotting的方法檢測了E-cad，N-cad和Vimetin蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（如圖2A，B，C，D所示）：與siha以及陰性對(duì)照Siha-nc（m）組比較，轉(zhuǎn)染mimic組E-cad表達(dá)下調(diào)顯著，N-cad及Vimentin表達(dá)顯著上調(diào)；與siha以及陰性對(duì)照Siha-nc（i）組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor組E-cad表達(dá)上調(diào)顯著，N-cad及Vimentin表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明干擾miRNA221能阻止宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖2 干擾miRNA221對(duì)E-cad，N-cad和Vimetin表達(dá)變化的影響.與Siha 組和Siha-nc（mimic）組比較，P<0.05。

2.3 干擾m iRNA 221的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株siha遷移能力的影響為了觀察干擾miRNA221表達(dá)對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞株遷移行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（如圖3所示）：與Siha以及陰性對(duì)照Siha-nc（m）組比較，宮頸癌細(xì)胞株Siha培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)染mimic的siha-m組細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)明顯；與Siha以及陰性對(duì)照siha-nc（i）組比較，宮頸癌細(xì)胞株Siha培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)染inhibitor的Siha-i組細(xì)胞遷移能力減弱明顯。這表明干擾miRNA221能減弱宮頸癌細(xì)胞的遷移能力。

圖3 干擾miRNA221的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha遷移能力的影響

2.4 干擾m iRNA 221的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株siha侵襲能力的影響為了觀察干擾miRNA221表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（如圖4所示）：與Siha和陰性對(duì)照Siha-nc（m）組比較，轉(zhuǎn)染mimic的Siha-m組細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)；與Siha和陰性對(duì)照Siha-nc（i）組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor的Siha-i組細(xì)胞遷移能力顯著減弱。這表明干擾miRNA221能減弱宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 干擾miRNA221的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響

3 討論

m iRNAs對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控是最近研究中的一個(gè)突破性發(fā)現(xiàn)，研究報(bào)道已在人類發(fā)現(xiàn)700多種miRNAs，參與調(diào)節(jié)機(jī)體基因表達(dá)，但大多數(shù)miRNAs在疾病中的功能及其作用機(jī)制尚未完全闡明。文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤的發(fā)生發(fā)展與miRNAs的異常調(diào)控有關(guān)［5，6］。

已有研究報(bào)道在乳腺癌，前列腺癌，肝癌等多種腫瘤中存在miRNAs差異表達(dá)，miRNAs的異常表達(dá)參與腫瘤侵襲，轉(zhuǎn)移等過程［3，4］。目前有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)基因芯片篩選及表達(dá)譜芯片分析得出miRNA221的表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系［7-9］。其支持的依據(jù)為：miRNA221在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)［7］；敲低miRNA221可以抑制腦膜膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展［8］；在甲狀腺乳頭狀癌中miRNA221的表達(dá)明顯增高［9］。通過整理文獻(xiàn)我們得出結(jié)論miRNA221在大多數(shù)腫瘤中可能是一個(gè)促癌因子，其表達(dá)異常也可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能存在一定的聯(lián)系。本研究在宮頸癌細(xì)胞株Siha上檢測miRNA221的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為間關(guān)系。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA221在宮頸癌細(xì)胞株Siha中扮演促癌因子的作用，與宮頸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子N-cad和VimetinmRNA相對(duì)表達(dá)量增加，與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的E-cadmRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)以及相應(yīng)蛋白N-cad和Vimetin表達(dá)增加和E-cad蛋白表達(dá)減少緊密有關(guān)，這表明miRNA221通過影響相關(guān)因子（E-cad，N-cad和Vimetin）而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株Siha的遷移侵襲能力增強(qiáng)。此外，我們利用過表達(dá)及抑制劑等一系列的分子生物學(xué)手段、劃痕及體外侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA221增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞株Siha的遷移能力和細(xì)胞增殖。通過干擾m iRNA221抑制宮頸癌細(xì)胞株Siha發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及減弱腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力，有利于腫瘤的轉(zhuǎn)歸和治療。

m iRNAs的異常表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miRNAs與其下游靶點(diǎn)的結(jié)合不是一對(duì)一的關(guān)系，可能為多個(gè)miRNAs同時(shí)作用于一個(gè)基因，一個(gè)miRNA的異常表達(dá)可以引發(fā)其下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而對(duì)下游靶基因進(jìn)行精確調(diào)控。因此，進(jìn)一步研究m iRNA221在宮頸癌細(xì)胞株Siha侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，為下一步探討miRNA221相關(guān)作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

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Effect of m iRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha

Mo Hong-ying1, Li Yu-fei2
(1. Department of Obstetrics and Gynecology Maternity and Children’s Health Care Centers of Changsha, Changsha 410007, China; 2. Hunan Normal University School of Medicine, Changsha 410006, China)

Objective To investigate the effect of miRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha. M ethod The experiment was divided into five groups: Siha, Siha-nc (mimic), Siha-nc (inhibitor), Siha-mimic, Siha-inhibitor. Testing the effect of miRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha by qPCR, Western blotting, the scratch test and Transwell chamber experiment. Results In Siha-mimic group, the expression of miRNA221 was significantly higher than that in Siha group and Siha-nc (mimic) group, the expression level of E-cad significantly decreased, the protein expressionsof N-cad and Vimentin significantly increased in Siha-inhibitor group, the expression of miRNA221 was significantly lower than that in Siha group and Siha-nc (inhibitor) group, the expression level of E-cad protein significantly increased, the expression levels of Vimentin and N-cad significantly decreased. Conclusion miRNA221 inhibits the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha.

cervical cancer; miRNA221; invasion and metastasis; E-cad; N-cad

R737.33

A

1673-016X（2017）03-0063-04

2017-01-03

李玉飛，E-mail：liyu fei666@163.com