豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒華南株GDgz的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

于林洋，董建國，2，張樂宜，劉燕玲，梁鵬帥，王 磊，宋長緒

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒華南株GDgz的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

于林洋1，董建國1，2，張樂宜1，劉燕玲1，梁鵬帥1，王 磊1，宋長緒1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

為了解華南地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）流行株的變異特性，用Marc-145細(xì)胞從廣東省疑似豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病豬場(chǎng)采集的肺組織中分離得到1株P(guān)RRSV（命名為GDgz），該毒株能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。全基因組進(jìn)化分析和同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，GDgz與中國高致病性毒株位于同一分支，與歐洲型毒株Lelystad-virus同源性最低、僅為60.3%，與美洲型經(jīng)典毒株VR-2332的同源性為88.8%，與中國高致病性毒株JXA1和HuN4同源性為98.8% 和98.9%，與JXA1的疫苗株同源性為91.1%，與NADC30和NADC30-like毒株 CHsx1401和JL580同源性分別為84.5%、87.2%和83.6%。NSP2序列比對(duì)結(jié)果顯示，GDgz在高變區(qū)存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失。GP5序列比對(duì)結(jié)果顯示，GDgz在GP5抗原表位上有氨基酸突變，表明GDgz屬于美洲型高致病性毒株傳代致弱的疫苗株，且在抗原表位上有一定程度的突變。

豬；繁殖與呼吸綜合征病毒；分離鑒定；遺傳進(jìn)化

豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征（P o r c i n e reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是造成當(dāng)今世界養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的傳染性疾病之一，它主要造成母豬的繁殖系統(tǒng)障礙和各年齡豬群的呼吸系統(tǒng)疾病［1-2］。該病的病原是豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（PRRSV）。PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬［3］。

PRRSV基因組全長約15 kb，含有10個(gè)開放閱讀框（ORFs）、5′端UTR、3′端UTR和poly（A）尾巴。開放閱讀框分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～7和ORF5a［4-5］。其中ORF1a和ORF1b進(jìn)行12個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1～Nsp12的編碼，在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和拮抗干擾素等方面起著重要作用［6-7］。ORF2～7進(jìn)行結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M和N的編碼［8］。病毒中和抗體生成有關(guān)的抗原表位主要位于結(jié)構(gòu)蛋白上［9］。5′端UTR用于調(diào)節(jié)病毒RNA功能及結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，3′端UTR位于ORF7下游，主要進(jìn)行病毒復(fù)制酶識(shí)別并結(jié)合以啟動(dòng)負(fù)鏈RNA的合成［10-11］。根據(jù)PRRSV變異以及流行情況，PRRSV可分為以Lelystad-virus為代表的歐洲型（Ⅰ型）和以VR2332為代表的北美型（Ⅱ型）［12］。我國PRRSV主要以基因Ⅱ型為主。PRRS對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是1996年以低致病性毒株CH-1a為代表和2006年以高致病性毒株JXA1為代表的兩次PRRS暴發(fā)對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失［13］。2014年，有研究報(bào)道NADC30-like毒株在我國廣泛流行，進(jìn)一步打擊了我國養(yǎng)豬業(yè)，也給PRRS的防控帶來了新挑戰(zhàn)［14-17］。

為了進(jìn)一步了解我國華南地區(qū)PRRSV的流行及變異情況，我們于2016年10月對(duì)廣東省廣州市某種豬場(chǎng)暴發(fā)疾病死亡的30日齡保育小豬進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果呈PRRSV陽性，最后通過在Marc-145細(xì)胞上將病毒成功分離并對(duì)其全基因組進(jìn)行測(cè)定和分析，將測(cè)序結(jié)果與其他代表PRRSV毒株進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析，進(jìn)而分析所分離的毒株與目前國內(nèi)PRRSV流行毒株的相似性，從而了解廣東省目前PRRSV毒株的流行情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 廣東省廣州市疑似暴發(fā)PRRS的自然發(fā)病豬，采集發(fā)病豬肺臟組織于-80℃凍存。

1.1.2 細(xì)胞、菌體及載體 本試驗(yàn)所使用的Marc-145細(xì)胞、克隆宿主菌E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞以及陽性對(duì)照病毒株GDzj株均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院豬病防控研究室保存。pMD-19T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Magen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒購于Promega公司；RT-PCR相關(guān)試劑盒購自TOYOBO生物科技有限公司和Vazyme公司；DNA Marker DL2000等購自TaKaRa公司； EB替代染料購自廣州華奇盛生物科技有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和Trans-5α感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)布的VR-2332等PRRSV毒株全基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)13對(duì)特異性引物（表1）用于擴(kuò)增全基因組序列。引物由蘇州金維智生物公司合成。

表1 PRRSV全基因組擴(kuò)增引物

1.2.2 病料處理及PCR檢測(cè) 將采集的發(fā)病豬肺臟組織剪碎，加入1 mL PBS研磨后收集研磨液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min，取上清用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，收集濾液并取200 μL進(jìn)行病毒DNA/RNA核酸提取及PRRSV NSP2、CSFV、PPV的 RT-PCR檢測(cè)與PRV、PCV2的常規(guī)PCR檢測(cè)，剩余濾液于-80℃保存。

1.2.3 病毒分離 使用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，待Marc-145細(xì)胞長滿單層后棄去上清，用PBS洗3遍，接種50 μL過濾過的含有病毒的病料上清，加入100 μL不含血清、含有2%雙抗的1 640培養(yǎng)液。37℃下孵育1 h后，棄去上清，加入含2%血清的1 640維持液1 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，約80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)CPE后即可收取樣品。將毒液置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 病毒接毒 使用25 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，待Marc-145細(xì)胞長滿單層后棄去上清，用PBS洗3遍，接種200 μL過濾的含有病毒的病料上清，加入1 mL不含血清的含有2%雙抗的1 640培養(yǎng)液。37℃下孵育1 h，棄去上清，加入含2%血清的1 640維持液5 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，約80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE后即可收取樣品。將毒液置于-80℃冰箱保存。

1.2.5 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄 取在Marc-145細(xì)胞上分離的第3代GDgz毒株，根據(jù)Magen公司產(chǎn)品試劑盒進(jìn)行病毒核酸提取，然后根據(jù)Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)所提取的病毒核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.6 PRRSV GDgz毒株目的片段分段擴(kuò)增 使用TOYOBO生物科技有限公司高保真酶對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，10×PCR Buffer for KODPlus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，cDNA模板4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，RNase Free H2O 28 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，62℃退火30 s，68℃延伸30 s/kb，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.7 序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收。然后連接到北京全式金生物有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上。經(jīng)過轉(zhuǎn)化挑菌鑒定后送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.8 序列比對(duì) 利用Lasergene及Mega 5.0軟件將分離的毒株全基因組與國內(nèi)外分離毒株進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，并分別將NSP2基因序列和GP5氨基酸序列與其他國內(nèi)外代表毒株的NSP2基因序列和GP5氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。PRRSV代表毒株的基因序列均來源于GenBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測(cè)

用NSP2基因檢測(cè)引物對(duì)處理好的病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增出NSP2基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明，與陽性對(duì)照片段大小一致（圖1），而樣品中RNA病毒CSFV、PPV與DNA病毒PRV、PCV2等檢測(cè)均呈陰性（圖略）。

圖1 PRRSV NSP2基因片段擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 病毒分離

將經(jīng)處理的病料接種到Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)48～96 h，每天觀察細(xì)胞情況，待細(xì)胞聚集、皺縮并脫落等有明顯CPE時(shí)，收取病毒液（圖2，封三）。

2.3 PRRSV全基因組測(cè)定

運(yùn)用13對(duì)相互重疊的特異性引物，通過RT-PCR法擴(kuò)增病毒的13個(gè)cDNA片段。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，擴(kuò)增的13 個(gè)RT-PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期長度一致（圖3）。將擴(kuò)增的片段膠回收后連接pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上送公司測(cè)序，最后對(duì)13個(gè)片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，SeqMan軟件拼接序列，獲得全長的PRRSV基因組序列，全長為15 353 nt，命名為GDgz。

2.4 PRRSV全基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

圖3 PRRSV基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

運(yùn)用分子生物學(xué)軟件對(duì)GDgz毒株和其他國內(nèi)外具有代表性的毒株進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果（圖4）顯示，整個(gè)遺傳進(jìn)化樹可分為以Lelystad virus為代表的歐洲型和以VR2332為代表的美洲型兩大分支，以VR-2332為代表的美洲型分支又可進(jìn)一步分為以美國NADC30株為代表的分支、以VR2332和我國低致病性毒株CH-1a為代表的分支以及以高致病性毒株JXA1、HUN4為代表的分支。結(jié)果表明，GDgz與國內(nèi)的高致病性毒株JXA1、HUN4、JXwn06屬于同一分支，且與高致病性毒株的疫苗株JXA1-P80同源性最高。

圖4 基于PRRSV全基因組的進(jìn)化樹分析

2.5 PRRSV全基因同源性分析

圖5 PRRSV全基因序列比對(duì)結(jié)果

用DNAStar軟件進(jìn)行PRRSV全基因的進(jìn)化分析，結(jié)果（圖5）顯示，GDgz與JXA1-P80同源性最高、為99.1%，與HP-PRRSV毒株JXA1、HUN4和JXwn06同源性分別為98.8%、 98.9%和98.9%，與NADC30和NADC30-like毒株 JL580、CHsx1401同源性分別為84.5%、87.2%和83.6%，與美洲型代表株VR-2332同源性為88.8%，與歐洲型代表株Lelystad virus同源性僅為60.2%。

2.6 PRRSV NSP2氨基酸序列比對(duì)

使用DANStar對(duì)GDgz和國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行NSP2氨基酸的序列比對(duì)，結(jié)果（圖6）顯示，GDgz與高致病性毒株HUN4、JXA1、JXwn06和高致病疫苗株JXA1-P80一樣，NSP2在511、534～562位存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失，在其他位點(diǎn)沒有氨基酸的缺失或插入。

圖6 PRRSV NSP2氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.7 PRRSV GP5氨基酸序列比對(duì)

運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)GDgz和國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行GP5蛋白的氨基酸序列比對(duì)，已有研究表明美洲型毒株GP5蛋白的表位有3個(gè)，2個(gè)（aa27～aa30 和 aa180～aa197）為非中和表位，1個(gè)（aa37～aa45）為中和表位（圖7），與美洲型代表毒株VR-2332相比，GDgz在非中和表位中有1個(gè)A29V的變異，與其他代表毒株相似；在185位有V185A突變，該突變與高致病性毒株及其疫苗株相似；在189位有I189L突變，該突變與國內(nèi)經(jīng)典毒株和高致病性毒株及其疫苗株相似。中和表位中，在39位有1個(gè)L39I突變，該突變與高致病性毒株及其疫苗株相似。

圖7 PRRSV GP5 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

3 討論

自從美國分離了第1株P(guān)RRSV毒株VR-2332以及1996年中國分離了第1株P(guān)RRSV CH-1a以來，PRRS已經(jīng)成為嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的疾病之一，每年導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國分離的毒株以北美型PRRSV毒株為主［18-19］，目前豬場(chǎng)主要通過疫苗免疫該病，國內(nèi)用于PRRSV防控的疫苗主要有經(jīng)典毒株和高致病性毒株減毒活疫苗以及滅活苗。由于我國PRRSV毒株種類眾多，研發(fā)生產(chǎn)疫苗的廠家眾多，致使疫苗使用混亂，一個(gè)豬場(chǎng)可能存在免疫多種疫苗的情況，導(dǎo)致不同毒株間發(fā)生遺傳重組的可能。加上RNA病毒復(fù)制酶低保真性和免疫系統(tǒng)壓力的影響，進(jìn)而加速PRRSV病毒不斷發(fā)生變異［20-21］。2006年出現(xiàn)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和2014年出現(xiàn)的NADC30-like毒株說明我國PRRSV變異情況越來越嚴(yán)重，致使現(xiàn)有疫苗免疫效果差，不能很好地提供免疫保護(hù)，給疾病防控造成了巨大困難。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒和RT-PCR方法對(duì)GDgz毒株全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，并克隆、測(cè)序，通過相關(guān)軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接后得到GDgz毒株的全基因序列，并對(duì)其與其他PRRSV毒株同源性進(jìn)行比較和構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示GDgz毒株與中國高致病性毒株JXA1疫苗株JXA1-P80同源性最高，表明廣東豬場(chǎng)由于廣泛使用減毒活疫苗，導(dǎo)致疫苗株在豬場(chǎng)廣泛流行，給PRRSV的變異增加了風(fēng)險(xiǎn)。

NSP2基因是PRRSV基因組上變異最大的基因之一，遺傳進(jìn)化分析表明，NSP2區(qū)域存在廣泛的基因缺失、插入和突變。有研究證實(shí)HPPRRSV毒株與經(jīng)典毒株相比在NSP2區(qū)域存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失［13］。對(duì)比國內(nèi)外NSP2氨基酸序列可知，GDgz的NSP2存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失，符合高致病性PRRSV毒株的特征。

抗原表位是決定病毒免疫特性的重要因素之一。目前，已有研究者證實(shí)美洲型 PRRSV GP5 蛋白抗原表位有1個(gè)中和表位和2個(gè)非中和表位［22］。GP5 蛋白由PRRSV ORF5 基因編碼，是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，為囊膜糖蛋白，具有較高的免疫原性和中和活性［23］。與美洲型代表毒株VR-2332相比，GDgz在非中和表位中有1個(gè)A29V的變異，在185位有V185A突變，在189位有I189L突變；中和表位中，在39位有1個(gè)L39I突變。這些突變很可能影響蛋白的免疫原性，進(jìn)而影響疫苗的免疫效果，導(dǎo)致豬場(chǎng)免疫失敗，PRRS暴發(fā)和流行。

最近國內(nèi)新出現(xiàn)了NADC30-like毒株，有研究證實(shí)該類毒株具有高致病性，是由中國高致病性毒株和美國NADC30毒株發(fā)生重組所致，商品化疫苗對(duì)該類型毒株缺乏免疫保護(hù)作用。我們分離的毒株與商品化疫苗JXA1-P80高度同源，這些結(jié)果表明弱毒苗的廣泛使用導(dǎo)致中國 PRRSV 毒株變異情況越來越嚴(yán)重，有必要開發(fā)新型疫苗預(yù)防疾病發(fā)生，早日解決PRRS感染與流行的問題。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Isolation，identification and genetic variation analysis of South China strain GDgz of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

YU Lin-yang1，DONG Jian-guo1，2，ZHANG Le-yi1，LIU Yan-ling1，LIANG Peng-shuai1，WANG Lei1，SONG Chang-xu1
（1. College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. College of Animal Husbandry and Veterinary，Xinyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000，China）

To understand the evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in South China，we isolated a PRRSV strain in Marc-145 cell from lung of suspected PRRSV-positive pig in South China and named GDgz. GDgz strain could cause typical cenotaphic effect. The results of phylogenetic tree and homology alignment analysis showed that GDgz belonged to the same cluster with high pathogenetic PRRSV（HPPRRSV） strains in China；GDgz had a far distance with European strain Lelystad virus，the nucleotide homology was only 60.3%，with American classic strain VR-2332 was 88.8%，with Chinese HP-PRRSV strains JXA1 and HuN4 were 98.8% and 98.9%，with the vaccine strain JXA1-P80 of JXA1 was 99.1%，with NADC30 and NADC30-like strains CHsx1401 and JL580 were 84.5%，87.2 and 83.6%，respectively. The result of sequence alignment showedthat there were 30 discontinuous amino acids deletion in the high variable region of NSP2. These results showed that GDgz belonged to vaccine strain of high pathogenetic North American type PRRSV and had some mutations in the epitope region.

porcine；reproductive and respiratory syndrome virus；isolation and identification；genetic variation

S855.3

A

1004-874X（2017）04-0138-08

于林洋，董建國，張樂宜，等. 豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒華南株GDgz的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（4）：138-145.

2017-02-19

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD12B02-5）

于林洋（1992-），男，在讀碩士生，E-mail: 396329755@qq.com

宋長緒（1965-），男，博士，研究員，E-mail: cxsong2004@163.com