377份多樣性國(guó)際稻種低溫發(fā)芽力評(píng)價(jià)

楊志濤，李 媛，張少紅，楊梯豐，趙均良，董景芳，陳光輝，劉 斌，，

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.廣東省農(nóng)科院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

377份多樣性國(guó)際稻種低溫發(fā)芽力評(píng)價(jià)

楊志濤1，李 媛2，張少紅3，楊梯豐3，趙均良3，董景芳3，陳光輝1，劉 斌1，2，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.廣東省農(nóng)科院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

低溫發(fā)芽力差是華南雙季稻早季水稻直播的主要限制因素之一。在稻種資源中篩選鑒定強(qiáng)低溫發(fā)芽力的種質(zhì)，開展強(qiáng)低溫發(fā)芽力水稻育種是解決這一問題最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。為了篩選強(qiáng)低溫發(fā)芽力的種質(zhì)，在13℃低溫下對(duì)377份來(lái)自56個(gè)國(guó)家和地區(qū)的多樣性水稻種質(zhì)的發(fā)芽力進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，這些稻種低溫發(fā)芽率的變異范圍在0～98.0%之間，平均值為37.6%，變異系數(shù)為76.4%，表現(xiàn)出豐富的多樣性。鑒定出21份低溫發(fā)芽率超過(guò)90%的優(yōu)良種質(zhì)。比較秈稻、粳稻和Aus稻3種類型稻種的低溫發(fā)芽率結(jié)果顯示，秈稻組平均低溫發(fā)芽率為48.7%，粳稻組為33.6%，Aus稻組為22.9%，秈稻組低溫發(fā)芽率極顯著高于粳稻和Aus稻組，粳稻組低溫發(fā)芽率顯著高于Aus稻組。研究結(jié)果為水稻強(qiáng)低溫發(fā)芽力種質(zhì)的收集提供了科學(xué)依據(jù)，并為水稻低溫發(fā)芽力改良和分子遺傳研究挖掘了優(yōu)良材料。

水稻；低溫發(fā)芽力；種質(zhì)鑒定；直播

20世紀(jì)90年代后，我國(guó)的水稻生產(chǎn)發(fā)生了較大的變化。一方面，水稻生產(chǎn)目標(biāo)從追求產(chǎn)量向降低成本、提高經(jīng)濟(jì)效益轉(zhuǎn)變；另一方面，隨著我國(guó)第二第三產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)農(nóng)村主要?jiǎng)趧?dòng)力向城鎮(zhèn)轉(zhuǎn)移，農(nóng)村勞動(dòng)力緊缺已成為水稻生產(chǎn)發(fā)展的主要約束因素。在這樣的背景下，水稻直播由于省時(shí)、省工和節(jié)約成本，深得農(nóng)民的歡迎，并迅速推廣。據(jù)全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心不完全統(tǒng)計(jì)，截至2015年，水稻直播面積在安徽省已達(dá)56.8萬(wàn)hm2，湖北省為49.1萬(wàn)hm2，江西省為43.3萬(wàn)hm2，江蘇省為40.9萬(wàn)hm2，浙江省為27.5萬(wàn)hm2，而廣東省也從2011年的2.1萬(wàn)hm2上升到10.5萬(wàn)hm2（http：//www.natesc.org.cn）。盡管我國(guó)水稻直播近年來(lái)有較大發(fā)展，但是與國(guó)外很多國(guó)家相比，還有很大差距。以廣東為例，2015年廣東省水稻直播面積為10.5萬(wàn)hm2，僅占全省水稻總種植面積的5%左右（廣東省現(xiàn)有水稻種植面積約為194.3萬(wàn)hm2）。美國(guó)和澳大利亞水稻種植全部為機(jī)械直播，意大利直播超過(guò)了98%，而到1997年亞洲直播水稻面積占水稻總種植面積的21%～22%［1］。我國(guó)與其他國(guó)家的差距在于我們對(duì)水稻直播缺乏專門、系統(tǒng)的研究。與育秧移栽的栽培方式不同，由于所處生境條件的不同，適合直播的水稻品種需要有不同的特性。其中，廣東等華南雙季稻地區(qū)早稻播種往往會(huì)遇到低溫天氣，這就要求用于直播的水稻種子有較強(qiáng)的低溫發(fā)芽力。然而，現(xiàn)有的許多推廣品種低溫發(fā)芽力差，不適合直播。研究表明，水稻低溫發(fā)芽力是多基因控制的數(shù)量性狀［2-4］，應(yīng)用常規(guī)育種技術(shù)很難進(jìn)行有效育種。因此，從廣泛的水稻資源中篩選鑒定強(qiáng)低溫發(fā)芽力的水稻種質(zhì)，在基因水平上深入了解這一性狀的分子遺傳基礎(chǔ)，強(qiáng)低溫發(fā)芽力的水稻育種才能取得突破。本研究對(duì)來(lái)自56個(gè)國(guó)家及地區(qū)、不同類型的377份多樣性國(guó)際稻種低溫發(fā)芽力進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以篩選鑒定出低溫發(fā)芽力強(qiáng)的水稻種質(zhì)，為直播水稻品種的選育和低溫發(fā)芽力相關(guān)基因標(biāo)記鑒定研究奠定材料基礎(chǔ)；并通過(guò)不同類型水稻種質(zhì)低溫發(fā)芽力的比較分析，為強(qiáng)低溫發(fā)芽力水稻種質(zhì)的收集和篩選鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為從國(guó)際水稻研究所引進(jìn)的、來(lái)源于56個(gè)國(guó)家及地區(qū)的377份多樣性國(guó)際稻種，于2015年晚造種植在廣州大豐試驗(yàn)基地，常規(guī)肥水及病蟲防控管理。成熟后收獲種子，曬干，室溫放置3個(gè)月后在空調(diào)房干燥貯存。

1.2 試驗(yàn)方法

為保證種子活力，選取收獲一年內(nèi)充實(shí)飽滿的種子。供試種子首先于49℃烘箱處理 96 h以打破休眠，經(jīng)3%次氯酸鈉溶液消毒后用于發(fā)芽試驗(yàn)。

常溫發(fā)芽試驗(yàn)：經(jīng)消毒的種子在適宜溫度（30℃）下萌發(fā)，以芽長(zhǎng)＞ 5 mm 為標(biāo)準(zhǔn)，5 d后調(diào)查其適溫發(fā)芽率。

低溫發(fā)芽試驗(yàn)：經(jīng)消毒的種子在適溫（30℃）下浸種24 h，然后放入墊有兩層濕潤(rùn)濾紙的直徑為7 cm培養(yǎng)皿中，置于13℃的生長(zhǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。每份稻種50粒種子，3次重復(fù)。以芽長(zhǎng)＞ 1 mm 作為低溫萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，處理后10 d調(diào)查種子低溫發(fā)芽率；然后升溫至30℃，5 d后再調(diào)查發(fā)芽率。

以低溫發(fā)芽率作為評(píng)價(jià)稻種低溫發(fā)芽力的指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用測(cè)試稻種的700K全基因組SNP數(shù)據(jù)［5］，根據(jù)稀有位點(diǎn)頻率（MAF）＞ 0.05，缺失數(shù)據(jù) ＜ 30%的標(biāo)準(zhǔn)，在全基因組范圍內(nèi)均勻選擇10%的SNP標(biāo)記，利用MEGA 4.0軟件［6］對(duì)測(cè)試稻種進(jìn)行聚類分析。

利用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及計(jì)算。通過(guò)SAS程序包［7］的 Duncan多重比較分析不同類型稻種低溫發(fā)芽力差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 377份國(guó)際稻種的群體結(jié)構(gòu)

根據(jù)多樣性國(guó)際稻種的70萬(wàn)個(gè)SNP標(biāo)記基因型，從12條染色體中均勻選取7萬(wàn)個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)377份稻種進(jìn)行聚類分析，把測(cè)試稻種分成秈稻、Aus稻和粳稻3組。其中，秈稻組154份、Aus稻組76份、粳稻組147份（圖1）。

圖1 377份稻種的SNP標(biāo)記聚類結(jié)果

2.2 377份國(guó)際稻種的種子活力

在適宜溫度（30℃）下，377份稻種平均發(fā)芽率為96.9%，變異系數(shù)為4.3%，其中，375份稻種在適宜溫度（30℃）下的發(fā)芽率均大于80%（圖2A），表明供試種子的休眠已被打破，發(fā)芽試驗(yàn)不受休眠影響，且種子活力正常。另外，為了解這些水稻種子在低溫處理下是否出現(xiàn)二次休眠［8-9］，測(cè)試的377份稻種經(jīng)過(guò)13℃低溫處理10 d后，轉(zhuǎn)到30℃適宜溫度下繼續(xù)萌發(fā)，5 d后測(cè)定其發(fā)芽率。結(jié)果表明，377份稻種平均發(fā)芽率為96.2%，變異系數(shù)為3.9%，除3份材料，374份稻種發(fā)芽率均大于80%（圖2B），表明供試種子在低溫下沒有二次休眠。

2.3 377份國(guó)際稻種的低溫發(fā)芽力

圖2 377份稻種在適宜溫度下的發(fā)芽率

以低溫發(fā)芽率表示稻種的低溫發(fā)芽力。在測(cè)試的377份稻種中，低溫發(fā)芽率的變異范圍在0～98.0%之間，平均值為37.6%，變異系數(shù)為76.4%。其中80份（占21.2%）稻種的低溫發(fā)芽率低于10.0%，21份（占5.6%）稻種的低溫發(fā)芽率超過(guò)90.0%，測(cè)試稻種低溫發(fā)芽力表現(xiàn)出豐富的多樣性（圖3A）。

2.4 不同類型稻種間的低溫發(fā)芽力

通過(guò)對(duì)377份稻種7萬(wàn)個(gè)SNP標(biāo)記基因型進(jìn)行聚類，并結(jié)合這些稻種原來(lái)的分類將其分成秈稻、Aus稻和粳稻3種類型（圖1），對(duì)不同類型稻種間的低溫發(fā)芽力進(jìn)行比較分析。在秈稻組的154份稻種中，低溫發(fā)芽率的變異范圍在0～98.0%之間，平均為48.7%，變異系數(shù)為62.1%，其中49.4%的稻種低溫發(fā)芽率大于50.0%，總體分布相對(duì)較平均（圖3B）；而76份Aus稻中，低溫發(fā)芽率的變異范圍在0～95.2%之間，平均為22.9%，變異系數(shù)為103.6%，只有14.5%的稻種低溫發(fā)芽率超過(guò)50.0%，總體分布明顯偏向低的低溫發(fā)芽率（圖3C）；在147份粳稻中，低溫發(fā)芽率的變異范圍在0～93.3%之間，平均為33.6%，變異系數(shù)為74.0%，有21.2%的稻種低溫發(fā)芽率大于50.0%，總體分布也是偏向低的低溫發(fā)芽力（圖3D）。3種類型稻種平均低溫發(fā)芽力差異顯著性分析結(jié)果（表1）表明，秈稻極顯著高于粳稻和Aus稻，而粳稻顯著高于Aus稻。

圖3 測(cè)試稻種的低溫發(fā)芽率分布

表1 3種類型稻種間低溫發(fā)芽力的差異

2.5 優(yōu)異低溫發(fā)芽力水稻資源篩選

在測(cè)試的377份稻種中，有21份稻種低溫發(fā)芽率超過(guò)90.0%，表現(xiàn)出強(qiáng)的低溫發(fā)芽力，其中14份為秈稻，5份為粳稻，2份為Aus稻。在同一試驗(yàn)觀察到廣東省部分推廣品種低溫發(fā)芽率低于20%（表2）。

3 討論

3.1 水稻低溫發(fā)芽力與稻種類型的關(guān)系

本研究對(duì)377份多樣性國(guó)際稻種的低溫發(fā)芽力研究結(jié)果表明，在稻種資源中，低溫發(fā)芽率有很大的變異。13℃低溫條件下，無(wú)論秈稻組、粳稻組或者Aus稻組，均有發(fā)芽率為零和發(fā)芽率超過(guò)90%的稻種。但從3組低溫發(fā)芽率的分布看，秈稻組中高的低溫發(fā)芽率稻種明顯多于粳稻組和Aus稻組，秈稻組種質(zhì)的平均低溫發(fā)芽率極顯著高于粳稻組和Aus稻組。在低溫發(fā)芽率超過(guò)90%的21份種質(zhì)中，14份為秈稻，占測(cè)試秈稻的9.1%，而粳稻只有5份，占測(cè)試粳稻的3.4%，Aus稻有2份，占測(cè)試Aus稻種質(zhì)的2.6%。說(shuō)明發(fā)芽期秈稻的耐冷性較粳稻和Aus稻強(qiáng)。這一結(jié)果與金銘路等［10］觀察到的粳稻種質(zhì)的發(fā)芽期耐冷性強(qiáng)于秈稻種質(zhì)的結(jié)果不同。而在芽期和苗期耐冷性方面，較多的研究表明粳稻強(qiáng)于秈稻［10-15］。由于秈稻和粳稻種植的生態(tài)氣候條件差異，普遍認(rèn)為粳稻的耐冷性較秈稻強(qiáng)，因此在以往水稻發(fā)芽期耐冷相關(guān)基因標(biāo)記鑒定的研究中，基本上是用粳稻作為強(qiáng)耐冷親本發(fā)展作圖群體［2-4，9，16-19］。從本研究發(fā)現(xiàn)秈稻發(fā)芽期耐冷性強(qiáng)于粳稻和Aus稻這一事實(shí)表明，在秈稻種質(zhì)資源中篩選鑒定強(qiáng)低溫發(fā)芽力的種質(zhì)會(huì)有更大的機(jī)會(huì)。此外，由于秈稻資源中有更多發(fā)芽期耐冷的種質(zhì)，在秈稻發(fā)芽期耐冷性改良育種中，不需要通過(guò)秈粳雜交來(lái)提高秈稻發(fā)芽期的耐冷性，在秈稻資源中篩選鑒定出發(fā)芽期耐冷的秈稻種質(zhì)，通過(guò)秈稻亞種內(nèi)的雜交將會(huì)更容易。

表2 低溫發(fā)芽率超過(guò)90%的種質(zhì)及部分推廣品種的低溫發(fā)芽率

3.2 水稻低溫發(fā)芽力的遺傳改良

水稻育種史的每一次突破都有賴于特異優(yōu)良材料的利用和技術(shù)的突破。在水稻耐冷性資源鑒定方面，利用不同類型、不同來(lái)源的種質(zhì)資源已篩選鑒定出一批芽期、苗期和抽穗開花期強(qiáng)耐冷的種質(zhì)［10，13］。本研究通過(guò)對(duì)377份多樣性稻種資源發(fā)芽期的低溫發(fā)芽力的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，篩選鑒定出21份低溫發(fā)芽率超過(guò)90%的水稻種質(zhì)，為水稻低溫發(fā)芽力遺傳改良和基礎(chǔ)研究奠定了很好的材料基礎(chǔ)。特別是本研究鑒定出14份強(qiáng)低溫發(fā)芽力的秈稻種質(zhì)，對(duì)華南秈稻區(qū)發(fā)芽期耐冷性育種和水稻直播的推廣有重要的意義。從我們對(duì)廣東的部分推廣品種低溫發(fā)芽率的檢測(cè)結(jié)果看，現(xiàn)有的很多水稻推廣品種低溫發(fā)芽力弱。其主要原因，一方面可能與育種親本的低溫發(fā)芽力不強(qiáng)有關(guān)；另一方面，低溫發(fā)芽力是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜性狀，由于常規(guī)遺傳育種方法無(wú)法準(zhǔn)確了解這一性狀的遺傳基礎(chǔ)，從而很難進(jìn)行有效育種。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，特別是近年來(lái)測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展為水稻低溫發(fā)芽力的遺傳解析提供了強(qiáng)大工具。通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析等方法將可以精確標(biāo)記鑒定出水稻低溫發(fā)芽力相關(guān)基因；通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，將可以高效準(zhǔn)確地選育出低溫發(fā)芽力強(qiáng)的水稻優(yōu)良品種，解決目前栽培稻低溫發(fā)芽力低的問題，從而推動(dòng)水稻直播的發(fā)展。

［1］ 趙步洪，戴正元，謝成林，等. 直播水稻的研究與應(yīng)用進(jìn)展及發(fā)展策略［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：13-15.

［2］ Hou M Y，Wang C M，Jiang L，et al. Inheritance and QTL mapping of low temperature germinability in rice（Oryza sativa L.）［J］. Acta Genetica Sinica，2004，31（7）：701-706.

［3］ Li L，Liu X，Xie K，et al. qLTG-9，a stablequantitative trait locus for low-temperature germination in rice（Oryza sativa L.）［J］. Theoretical and Applied Genetics，2013，126（9）：2313-2322.

［4］ Satoh T，Tezuka K，Kawamoto T，et al. Identification of QTLs controlling lowtemperature germination of the East European rice（Oryza sativa L.）variety Maratteli［J］. Euphytica，2016，207（2）：245-254.

［5］ McCouch S R，Wright M H，Tung C W，et al. Open access resources for genome-wide association mapping in rice［J］. Nature communications，2016，7.

［6］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4：Molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］. Molecular Biology and Evolution，2007，24（24）：1596-1599.

［7］ SAS Institute. SAS/STAT user’s guide，version 8.1［M］. SAS Institute Inc，Cary，North Carolina，USA，2000.

［8］ Miura K，Araki H. Low temperature treatment during the imbibitions period for the induction of secondary dormancy in rice seeds（Oryza sativa L.）［J］. Breeding Science，1996，46：235-239.

［9］ Jiang L，Liu S，Hou M，et al. Analysis of QTLs for seed low temperature germinability and anoxia germinability in rice（Oryza sativa L.）［J］. Field Crops Research，2006，98（1）：68-75.

［10］ 金銘路，楊春剛，余騰瓊，等. 中國(guó)水稻微核心種質(zhì)不同生育時(shí)期耐冷性鑒定及其相關(guān)分析［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2009，10（4）：540-546.

［11］ Pan Y，Zhang H，Zhang D，et al. Genetic analysis of cold tolerance at the germination and booting stages in rice by association mapping［J］. Plos one，2015，10（3）：e0120590.

［12］ Lv Y，Guo Z，Li X，et al. New insights into the genetic basis of natural chilling and cold shock tolerance in rice by genome-wide association analysis［J］. Plant Cell and Emvironment，2016，39：556-570.

［13］ 韓龍植，曹桂蘭，安永平，等. 水稻種質(zhì)資源芽期耐冷性的鑒定與評(píng)價(jià)［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5（4）：346-350.

［14］ 夏秀忠，張宗瓊，楊行海，等. 廣西水稻地方品種耐冷性鑒定及相關(guān)分析［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17（6）：969-975.

［15］ 楊梯豐，張少紅，王曉飛，等. 多樣性國(guó)際稻種四個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的耐冷性及其與秈粳性的關(guān)系［J］. 分子植物育種，2017，15（2）：763-773.

［16］ 鞏迎軍，阮雯君，荀星，等. 水稻芽性狀耐冷性的QTL分析［J］. 分子植物育種，2009（2）：273-278.

［17］ Fujino K，Sekiguchi H，Sato T，et al. Mapping of quantitative trait loci controlling low-temperature germinability in rice（Oryza sativa L.）［J］. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（5）：794-799.

［18］ Han L Z，Zhang Y Y，Qiao Y L，et al. Genetic and QTL analysis for low-temperature vigor of germination in Rice［J］. Acta Genetica Sinica，2006，33 （11）：998-1006.

［19］ Teng S，Zeng D，Qian Q. et al. Mapping quantitative trait loci controlling low temperature germinability in rice（Oryza sativa L.）［J］. Chinese Science Bulletin，2001，46（13）：1104-1108.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Evaluation of low temperature germinability of 377 national rice accessions

YANG Zhi-tao1，LI Yuan2，ZHANG Shao-hong3，YANG Ti-feng3，ZHAO Jun-liang3，DONG Jing-fang3，CHEN Guang-hui1，LIU Bin1，2，3
（1. College of Agronomy， Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2. College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；3. Guangdong Key Laboratory of New Technology in Rice Breeding/Rice Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

The poorer low temperature germinability（LTG）of rice cultivars in the early cropping-season is one of the main factors limiting direct seeding in the double cropping regions in South China. Screening rice germplasm with strong LTG and breeding rice variety with strong LTG is the most economical and effective way to solve this issue. To identify rice germplasm with strong LTG，377 rice accessions from 56 countries and regions were subjected to 13℃ and their germination rates at low temperature were evaluated. The results showed that LTG of these rice accessions varied from 0 to 98.0% and the average germination rate was 37.6% with 76.4% of variation coefficient. 21 accessions had a LTG over 90%. Significant differences in LTG were observed among the three types of rice，indica，Aus and japonica. The average LTG of indica was highly significantly higher than that of japonica and Aus （P＜0.01），respectively，and the average LTG of japonica was significantly higher than that of Aus （P＜0.05）. The results provide a good basis for screening of rice germplasm with strong low temperature germinabilityand the 21 rice accessions with LTG over 90% could be good materials for breeding and gene discovery associated with strong low temperature germinability in rice.

rice；low temperature germinabitity；germplasm identification；direct seeding

S511.01

A

1004-874X（2017）04-0001-06

楊志濤，李媛，張少紅，等. 377份多樣性國(guó)際稻種低溫發(fā)芽力評(píng)價(jià)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（4）：1-6.

2017-02-16

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015B020201001）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)共性關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2016LM2148）

楊志濤（1989-），女，在讀碩士生，E-mail：2858526692@qq.com

劉斌（1962-），男，博士，研究員，E-mail：lbgz1009@163.com