提高玉米愈傷組織再生率的研究

李海霞，孫金花，邢國(guó)珍，王愛(ài)武

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州450002）

提高玉米愈傷組織再生率的研究

李海霞，孫金花，邢國(guó)珍，王愛(ài)武

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州450002）

為了提高玉米愈傷組織再生率，以1個(gè)玉米自交系和3個(gè)雜交種的幼胚愈傷組織為試材，接入含有不同濃度2，4-D的分化預(yù)處理培養(yǎng)基（N6＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L），2，4-D濃度設(shè)0、0.5、1.0和1.5 mg/L計(jì)4個(gè)處理，培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化處理，以繼代培養(yǎng)7 d的愈傷組織直接轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行植株再生作為對(duì)照，研究了不同濃度2，4-D分化預(yù)處理對(duì)玉米愈傷組織再生率和再生進(jìn)程的影響。結(jié)果表明：愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基前進(jìn)行預(yù)處理，可以提高玉米植株再生率。分化預(yù)處理培養(yǎng)基以不加2，4-D的效果最好，玉米愈傷組織再生率最高，與對(duì)照差異達(dá)到了極顯著水平，且分化成苗進(jìn)程加快。不同基因型中，雜交種87-1×鄭22的植株再生率最高，與其他2個(gè)雜交種差異不顯著，但三者的植株再生率均極顯著高于自交系87-1。對(duì)玉米愈傷組織進(jìn)行分化前的預(yù)處理，可以提高植株再生率，加快再生進(jìn)程。

玉米；愈傷組織；分化；預(yù)處理；再生

生物技術(shù)的快速發(fā)展為玉米遺傳育種提供了新途徑，同時(shí)也對(duì)玉米組織培養(yǎng)體系提出了更高要求。愈傷組織作為基因轉(zhuǎn)化的一種受體，其再生成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵。自1975年Green等[1]利用玉米幼胚作為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織并成功獲得再生植株以來(lái)，玉米再生體系技術(shù)得到了不斷完善和發(fā)展，已經(jīng)利用玉米幼穗[2]、芽尖[3]、幼嫩花序[4]、花藥[5]、幼苗切段[6]、成熟胚[7]等外植體培養(yǎng)并成功獲得了再生植株。研究表明，在培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的山梨醇或脫落酸（ABA），可有效提高愈傷組織的植株再生頻率[8～10]；對(duì)秈稻愈傷組織進(jìn)行干燥處理后，可使其再生頻率極大提高[11]；玉米愈傷組織經(jīng)過(guò)吸濕干燥處理后，可以增加分化前期再生植株的比例[12]。前人對(duì)影響愈傷組織再生的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑研究，主要是在分化培養(yǎng)基中添加不同濃度的KT和6-BA[13～16]。而如何使愈傷組織從脫分化快速進(jìn)入再分化狀態(tài)還有待于探討。利用含有不同濃度2，4-D的培養(yǎng)基對(duì)玉米愈傷組織進(jìn)行分化前的預(yù)處理，研究其對(duì)玉米愈傷組織再生的影響，旨為提高玉米植株再生率提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料參試玉米愈傷組織為自交系87-1以及雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1和昌7-2×HⅡA繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織。

1.1.2 培養(yǎng)基配方繼代培養(yǎng)基：N6＋2，4-D 2.0 mg/L＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L；分化預(yù)處理培養(yǎng)基：N6＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L＋2，4-D（試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度）；分化培養(yǎng)基：N6＋6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖20 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的獲取取人工套袋授粉10～14 d的玉米雌幼穗，剝?nèi)￠L(zhǎng)1～2 mm的幼胚，在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)條件為無(wú)光照、溫度26℃，20 d左右繼代1次。

1.2.2 分化誘導(dǎo)預(yù)處理挑選生長(zhǎng)一致的繼代培養(yǎng)的愈傷組織，接入含有不同濃度2，4-D的分化預(yù)處理培養(yǎng)基，2，4-D濃度設(shè)0.0、0.5、1.0和1.5 mg/L計(jì)4個(gè)處理，依次記作S0.0、S0.5、S1.0和S1.5；培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行分化處理。以將愈傷組織接入正常繼代培養(yǎng)基，7 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行植株再生作為對(duì)照（CK）。每處理均接種10個(gè)培養(yǎng)皿，愈傷組織接種量10塊/皿，統(tǒng)計(jì)時(shí)去除培養(yǎng)過(guò)程中污染的處理。每周統(tǒng)計(jì)愈傷組織再生苗數(shù)、綠色愈傷數(shù)、生根數(shù)，以及5周的總出苗數(shù)（以苗高1.5 cm以上為出苗標(biāo)準(zhǔn)），計(jì)算愈傷組織再生率（%，出苗的愈傷組織塊數(shù)/誘導(dǎo)再生愈傷組織塊數(shù)×100）。并肉眼觀察不同處理的愈傷組織再生進(jìn)程。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較、方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度2，4-D分化預(yù)處理對(duì)玉米愈傷組織再生率的影響

將玉米愈傷組織接入含有不同濃度2，4-D的分化預(yù)處理培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后結(jié)果（表1）顯示，除了個(gè)別預(yù)處理外，大部分基因型愈傷組織經(jīng)過(guò)預(yù)處理的再生率與CK相比有不同程度的提高，其中，S0.0處理87-1、87-1×鄭22、鄭22×87-1和昌7-2×HⅡA的再生率分別為13.33%、40.00%、31.33%和27.78%，均明顯＞其CK。相同濃度的2，4-D處理下，雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1和昌7-2×HⅡA的再生率均＞自交系87-1。

表1 不同濃度2，4-D分化預(yù)處理對(duì)玉米愈傷組織再生率的影響Table 1 Effect differenciation pretreatment w ith different 2，4-D concentration on callus regeneration rate of maize

對(duì)分化過(guò)程中不同基因型和不同濃度2，4-D分化預(yù)處理的愈傷組織再生差異進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表2）顯示，玉米基因型和2，4-D濃度均對(duì)愈傷組織再生有顯著影響，其中，基因型的影響極為顯著。進(jìn)一步對(duì)不同基因型之間的再生差異進(jìn)行顯著性比較后發(fā)現(xiàn)，雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA的出苗率差異不顯著，但均與自交系87-1差異達(dá)到了極顯著水平（表3）；對(duì)不同濃度2，4-D處理之間的再生差異進(jìn)行顯著性比較后發(fā)現(xiàn)，4個(gè)分化預(yù)處理之間差異均不顯著，但是，S0.0處理與CK差異達(dá)到了極顯著水平，而其他3個(gè)處理與CK差異均不顯著（表4）。

表2 不同基因型和2，4-D濃度對(duì)玉米愈傷組織再生差異的方差分析Table 2 ANOVA analysis of regeneration on genotype w ith different 2，4-D concentration treatment

表3 不同基因型的玉米愈傷組織再生率差異顯著性比較Table 3 Difference com parison of regeneration rate w ith difference genotypes

表4 不同濃度2，4-D處理的玉米愈傷組織再生率差異顯著性比較Table 4 Difference comparison of regeneration rate with 2，4-D concentration treatment

2.2 不同濃度2，4-D分化預(yù)處理對(duì)玉米愈傷組織再生進(jìn)程的影響

不同濃度的2，4-D分化預(yù)處理，對(duì)玉米愈傷組織再生進(jìn)程的影響明顯不同（表5）。分化第1周，僅S0.0處理下雜交種87-1×鄭22和鄭22×87-1有苗長(zhǎng)出，再生率分別為2.86%和8.89%；而CK無(wú)再生苗。分化第2周，S0.0處理的雜交種87-1×鄭22和鄭22× 87-1的出苗數(shù)繼續(xù)增多，出苗率分別達(dá)到了15.71%和14.44%；昌7-2×HiⅡA也開(kāi)始有苗分化，出苗率為1.11%。分化第3周，CK中僅昌7-2×HiⅡA有1株苗分化，而其他基因型仍沒(méi)有出苗；自交系87-1 S0.0處理開(kāi)始有苗分化，分化率為6.67%，而其CK直到第5周才開(kāi)始有苗分化，分化率為4.00%。表明分化預(yù)處理可以加快玉米植株的再生進(jìn)程，且使綠色愈傷組織和生根數(shù)增多。該結(jié)果與實(shí)際觀察結(jié)果（圖1）一致。

3 結(jié)論與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)與分化過(guò)程具有重要作用，同種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同濃度、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的相互作用對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)與分化產(chǎn)生重要影響。2，4-D能啟動(dòng)脫分化，誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，在繼代過(guò)程中，2，4-D具有防止愈傷組織褐化的作用[18]。2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織必不可少的因素，其濃度至關(guān)重要[19]。各類植物激素的生理作用具有相對(duì)的專一性，誘導(dǎo)脫分化與分化的過(guò)程需要不同植物激素的調(diào)控。2，4-D是誘導(dǎo)體細(xì)胞發(fā)生的重要物質(zhì)，主要促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。在附加2，4-D的N6或MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，但當(dāng)其轉(zhuǎn)入含有KT和6-BA的培養(yǎng)基后，體細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，分化形成再生植株。早在20世紀(jì)60年代國(guó)外學(xué)者就建立了胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生體系，胡蘿卜在含有2，4-D的MS培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)愈傷組織和胚性愈傷組織的形成，當(dāng)轉(zhuǎn)移至無(wú)2，4-D的MS培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的形成與發(fā)育[20]。

表5 S0.0處理對(duì)玉米愈傷組織再生進(jìn)程的影響Table 5 Effect of S0.0treatment on callus regeneration proceeding of maize

圖1 S0.0處理第1周時(shí)的玉米愈傷組織分化狀態(tài)Fig.1 Comparison the regeneration between CK and S0.0treatment after 1 week

在組織培養(yǎng)中愈傷組織的繼代和分化需要不同的植物調(diào)節(jié)劑，如何縮短2種控制不同培養(yǎng)狀態(tài)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的交互作用時(shí)間，使組織細(xì)胞盡快以旺盛的生命力從繼代培養(yǎng)進(jìn)入到分化狀態(tài)，生成再生植株至關(guān)重要。本研究采用不同濃度的2，4-D進(jìn)行分化前預(yù)處理，對(duì)玉米愈傷組織再生率及再生進(jìn)程進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中不加2，4-D進(jìn)行分化前預(yù)處理，對(duì)提高玉米愈傷組織植株再生率效果明顯，各基因型反應(yīng)一致。低濃度的2，4-D對(duì)愈傷組織的處理也與CK有明顯區(qū)別，普遍提高了玉米愈傷組織的植株再生率。原因是2，4-D濃度降低，減弱了體細(xì)胞增生的趨勢(shì)，愈傷組織一旦轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，吸收KT和6-BA后，能使這2種物質(zhì)快速發(fā)揮作用，促進(jìn)其分化出苗。這種處理方法對(duì)提高玉米植株再生率，尤其是某些再生植株困難的基因型有一定的實(shí)用價(jià)值，并對(duì)玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究具有特別意義。

再生苗的健壯程度是影響組培苗移栽成活率的一個(gè)重要因素。實(shí)踐證明，分化速度快、莖稈粗壯、葉片較寬的再生苗，移栽后緩苗期短，移栽成活率高。在愈傷組織分化過(guò)程中，加快愈傷組織植株再生，縮短分化出苗時(shí)間對(duì)獲取健壯植株至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，不加2，4-D的分化預(yù)處理，愈傷組織變綠速度較不進(jìn)行分化預(yù)處理的對(duì)照快，且顏色濃綠，綠色面積更大，愈傷組織的分化進(jìn)程明顯加快。因此，分化前降低繼代培養(yǎng)基2，4-D濃度對(duì)玉米愈傷組織的分化起著一定的調(diào)控作用，有利于體細(xì)胞胚的形成，對(duì)分化有促進(jìn)作用。

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Study on Improvement of Callus Regeneration Frequency in M aize

LI Hai-xia，SUN Jin-hua，XING Guo-zhen，WANG Ai-wu
（He’nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

In order to improve the regeneration rate on maize callus，different 2，4-D concentration including 0，0.5，1.0 and 1.5 mg/L were used to pretreatment callus media of N6+700 mg/L proline+500 mg/L casein hydrolysate+30 g/L sucrose.The regenerate rate of different media after 7 days transformation was compared with CK as directly transformation.The effects of different 2，4-D concentration of differentiation pretreatments on callus regeneration frequency and regeneration process were investigated by using one inbred line and three hybrids immature embryos of maize as experimental materials.The results indicated that there was a significant increase on regeneration frequency with different 2，4-D concentration of pretreatments before transferred to differentiation medium. The pretreatment medium without 2，4-D could significantly improve the maize regeneration seedling frequency and accelerate the plant regeneration process.There was a significant different regeneration frequency with various genotype calluses.With the increase of 2，4-D concentration，the regeneration frequency of the same genotype callus was in a downward tendency in the several experimental genotypes.There was a highest regeneration rate on hybrids 87-1×Zheng 22 and no significant difference with other 2 hybrids.The plant regeneration frequency of three hybrids was generally higher than that of inbred line of 87-1.This demonstrated that the pretreatment with maize callus can increase the plant regeneration frequency and accelerate the regenerate process.

Maize；Callus；Differenctiation；Pretreatment；Regeneration

Q813.1

：A

：1008-1631（2017）02-0057-04

2016-09-07

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A180039）；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（KF1613）

李海霞（1972-），女，河南輝縣人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事植物生理生化研究。E-mail：527801231@qq.com。