丹參素冰片酯影響大鼠腦組織P-糖蛋白表達(dá)研究

張 鄭，楊 黎，朱凱莉，周 安，惠愛玲，張文成，吳澤宇

(1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院天然藥物研究所，安徽 合肥 230009；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

丹參素冰片酯影響大鼠腦組織P-糖蛋白表達(dá)研究

張 鄭1，楊 黎1，朱凱莉1，周 安2，惠愛玲1，張文成1，吳澤宇1

(1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院天然藥物研究所，安徽 合肥 230009；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

目的 考察丹參素冰片酯(DBE)及丹參素鈉-冰片(SDSS-B)等摩爾聯(lián)合用藥的腦部靶向作用與其對P-糖蛋白表達(dá)的影響。方法 采用LC-MS分析大鼠尾靜脈注射DBE、SDSS-B及SDSS后腦部丹參素分布量；蛋白免疫印跡法分析3種給藥方式對大鼠腦組織P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)量的影響。結(jié)果 以大鼠腦部丹參素分布定性評價(jià)其腦靶向大小為：DBE(SDSS-B)>SDSS；蛋白免疫印跡結(jié)果分析顯示：DBE和SDSS-B給藥均可有效降低大鼠海馬組織P-gp表達(dá)水平(P<0.01，與Control組對比；P<0.01，與SDSS組對比)，其表達(dá)量在給藥45 min時(shí)分別降至(47.58±2.28)%及(46.54±1.41)%；SDSS給藥對P-gp表達(dá)量幾乎無明顯抑制作用(P>0.05在5、15、45、60 min，與Control組對比)。結(jié)論 DBE和SDSS-B均表現(xiàn)出腦部靶向作用，其靶向作用與其降低腦組織P-gp表達(dá)量有關(guān)。

丹參素；冰片；丹參素冰片酯；聯(lián)合用藥；腦靶向；P-糖蛋白；蛋白免疫印跡法

丹參素(Danshensu, DSS)，化學(xué)名稱為D-(+)-β-(3,4-二羥基苯基)乳酸，是中藥丹參的主要活性成分之一，它能緩解腦缺血/再灌注大鼠的腦組織病理性損傷、減弱其神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]，其亦能穿透血腦屏障(blood brain barrier, BBB)到達(dá)腦部[2]，上述研究表明丹參素有望用于腦血管相關(guān)疾病的治療。然而，丹參素(Fig 1)結(jié)構(gòu)中含有不穩(wěn)定的鄰二酚羥基，易發(fā)生氧化，性質(zhì)不穩(wěn)定；而且其羧基能夠和人體內(nèi)葡萄糖醛酸等結(jié)合隨尿液排出體外，故在體內(nèi)半衰期也非常短，這也限制了它的臨床應(yīng)用[3]。另外，盡管靜脈給予丹參素(15 mg·kg-1)15 min，其腦部濃度達(dá)4.6 μg·g-1；但30 min腦部濃度已降低60%[2]，這除了腦細(xì)胞對丹參素清除效應(yīng)外，BBB上存在的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)外排泵作用對丹參素轉(zhuǎn)運(yùn)至腦亦具有抑制作用[3-4]。故此，本實(shí)驗(yàn)室以具有P-gp抑制作用的小分子或藥效團(tuán)為載體，設(shè)計(jì)合成了一系列丹參素腦靶向衍生物，如丹參素-吡嗪酯(DT1、DT2、DT3)[5]、丹參素冰片酯(Danshensu borneol ester, DBE)及其乙?；a(chǎn)物(Ac-DBE)(Fig 1)等。

Fig 1 Chemical structure of Danshensu and its brain-targeting derivatives

A: Danshensu; B: DT1; C: DT2; D: DT3; E: DBE; F: Ac-DBE

DBE是將冰片(borneol)分子的羥基引入丹參素羧基發(fā)生1 ∶1(摩爾比)酯化的產(chǎn)物。已有研究表明，冰片能促進(jìn)藥物透過BBB，提高其他藥物生物利用度[6]；且能促進(jìn)川芎嗪[7]、丹參素[8]、梔子苷[9]等通過BBB，增加其腦組織濃度，如丹參-冰片配伍(折算為丹參素 ∶冰片=1 ∶5，摩爾比)能使家兔腦組織的丹參素濃度由0.174 μg·g-1提高至0.637 μg·g-1[8]。此外，冰片能抑制P-gp對長春新堿、木通皂苷D的外排作用，提高其細(xì)胞內(nèi)濃度[10-11]。DBE分子由冰片-丹參素綴合而成，冰片的引入是否會(huì)促使DBE更易跨越BBB，并對P-gp產(chǎn)生抑制作用，這種作用與丹參素鈉(sodium Danshensu, SDSS)-冰片等摩爾聯(lián)合給藥(SDSS-B)相比是否更有優(yōu)勢？因此，對DBE及SDSS-B給藥后的腦部分布及其對腦組織P-gp調(diào)控作用研究尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，BBB通透性增加、P-gp ATP酶活性升高、P-gp表達(dá)水平及外排功能減弱均有助于銀杏內(nèi)酯前藥PGB的腦靶向效率提高[12-13]。為此，本文采用LC-MS初步分析大鼠尾靜脈注射DBE、SDSS-B及SDSS后的腦部分布規(guī)律，以此推測DBE及SDSS-B的腦部靶向作用。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白免疫印跡法(Western blot)深入探究其對大鼠腦組織P-gp表達(dá)量的影響，為丹參素等CNS藥物的腦靶向藥物設(shè)計(jì)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 丹參素冰片酯(DBE)為實(shí)驗(yàn)室自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR、MS 確證，HPLC純度>98%；丹參素鈉(SDSS)為南京斯道夫生物科技有限公司提供，HPLC純度>98%；天然冰片購自江西省吉安市林科天然冰片廠，批號：057001；Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb(C219)購自美國Calbiochem；β-actin(C4): sc-47778 購自美國Santa Cruz Biotechnology, Inc；山羊抗小鼠IgG HRP購自合肥Biosharp公司；PageRuler Prestained Protein Ladder購自Thermo Scientific；丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(1 ∶29)購自上海生工生物工程有限公司；Aprotini(抑肽酶)、Leupetin(亮抑酶酞)、NP-40、脫氧膽酸鈉、PMSF、EDTA、Tris購自Sigma公司；其他試劑購自國藥集團(tuán)，均為分析純。

1.1.2 儀器 電子分析天平、標(biāo)準(zhǔn)PB-10酸度計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1600紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；Sigma 3K15離心機(jī)，德國Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司；Bio-Rad Powerpac Basic電泳儀、Bio-Rad Mini Protein 3 Cell 電泳槽，美國Bio-Rad公司；DYCZ-40D轉(zhuǎn)膜槽，北京市六一儀器廠；FCE化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Protein Simple公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂♀兼用，體質(zhì)量(225±25) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證SCXK(皖)2005-001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫(20±2)℃。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，期間自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 DBE及SDSS-B聯(lián)合給藥的腦部靶向作用分析

1.2.1.1 動(dòng)物分組及給藥 SD大鼠隨機(jī)分為DBE給藥組(45.5 mg·kg-1)、SDSS-B聯(lián)合給藥組(30 mg·kg-1～21 mg·kg-1，SDSS與B等摩爾劑量)、SDSS給藥組(30 mg·kg-1)和控制組(僅給予溶媒，聚乙二醇400 ∶乙醇=8 ∶2)，尾靜脈注射給藥，于給藥后5、15、30、45、60 min，經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采血，取血后立即取出腦組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重后加入4倍量生理鹽水(kg·L-1)制成腦勻漿，于-20℃保存，待測。

1.2.1.2 生物樣品處理 精密吸取腦勻漿1.0 mL，加入對羥基苯甲酸溶液10 μL(1 mg·L-1，內(nèi)標(biāo))，混勻后加入體積分?jǐn)?shù)為0.1的高氯酸溶液100 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩1 min后加入乙酸乙酯2 mL，渦旋振蕩3 min，4℃離心(12 000 r·min-1，10 min)，取上層有機(jī)相，40℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，離心10 min，取上清液進(jìn)行LC-MS分析。

1.2.1.3 測定條件 色譜條件：色譜柱Thermo Syncronis-C18(2.1 mm×100 mm，5 μm); 流動(dòng)相A是體積分?jǐn)?shù)為0.001的甲酸水溶液，B為乙腈，流速為0.3 mL·min-1，梯度洗脫(0～3 min, 70% B-90% B; 3～4 min, 90% B-90% B; 4～5 min, 90% B-70% B)，進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI源；掃描方式：負(fù)離子多反應(yīng)檢測(MRM)方式掃描；毛細(xì)管電壓4.2 kV,離子源溫度為280℃，霧化器流量8 L·min-1,碰撞氣流量：3.5 L·min-1，選擇離子對DSS 197.20/179.05；內(nèi)標(biāo)137.30/119.20。

1.2.2 DBE及SDSS-B聯(lián)合給藥對大鼠腦部P-gp表達(dá)的影響

1.2.2.1 分組及給藥 分組與給藥同“1.2.1.1”。分別于5、15、30、45、60 min，斷頭處死給藥組及溶媒控制組，立即取出腦組織，剝?nèi)『ｑR、腦皮質(zhì)，剩余腦組織-80℃保存待用。

1.2.2.2 組織總蛋白提取及Bradford法定量 從-80℃冰箱取出海馬、皮質(zhì)及剩余腦組織，加入配制好的組織裂解液，在冰上充分?jǐn)囁椴⒘呀? h，4℃離心(14 000 r·min-1)10 min，吸取上清液用考馬斯亮藍(lán)染色，595 nm測吸光度并計(jì)算樣品蛋白含量。按照20 μL含50 μg蛋白標(biāo)準(zhǔn)制備Western blot所需蛋白樣品。每份總蛋白與2×SDS-sample buffer按1 ∶1體積混勻后，沸水中煮10 min，室溫冷卻待用。

1.2.2.3 Western blot步驟 分離膠與濃縮膠制備好后，所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將濾紙、凝膠及PVDF膜夾好放入轉(zhuǎn)移槽中，恒流350 mA，轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST緩沖液清洗膜，5%脫脂牛奶室溫條件下封閉1 h。封閉結(jié)束后TBST洗3次，將PVDF膜剪成分別含有P-gp和β-actin的兩部分，分別使用P-gp抗體和β-actin抗體，4℃孵育過夜。TBST洗3次后，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗3次后，顯影成像。Image J軟件分析目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 DBE及SDSS-B聯(lián)合給藥的腦部靶向作用分析 大鼠尾靜脈注射DBE，給藥15 min后，在腦勻漿中即檢測到DBE及DBE降解的DSS。若以15 min或30 min SDSS組中分析物(DSS)與內(nèi)標(biāo)(HBA)強(qiáng)度比值定為1，則DBE組在15、30 min的相對量分別達(dá)到(2.54±0.77)及(2.41±0.63)；SDSS-B組則為(2.80±0.61)及(1.93±0.17)，如Fig 2、3 所示。與直接注射SDSS組相比，DBE及SDSS-B 組在15 min或30 min的腦勻漿DSS分布均有較大幅度提高(P<0.01)。在給藥15 min時(shí)，DBE組DSS腦部分布相比SDSS-B略低，這可能與DBE需緩慢釋放DSS有關(guān)；隨著給藥時(shí)間延長至30 min，DBE組DSS腦部量較SDSS-B組提高24.9%。以上分析表明，將丹參素DSS改造成脂溶性DBE后，其更易透過BBB，且能在腦部緩慢分解得到DSS，并有可能呈現(xiàn)出長效緩釋特性，這對腦血管疾病的長期用藥是非常有利的。

2.2 DBE及SDSS-B聯(lián)合給藥對大鼠腦組織P-gp表達(dá)的影響

2.2.1 大鼠腦組織不同區(qū)域P-gp表達(dá) 以β-actin為內(nèi)參，采用Western blot檢測了溶媒控制組(Control組)大鼠腦組織不同區(qū)域P-gp表達(dá)水平(Fig 4)，海馬、腦皮質(zhì)及剩余腦組織的P-gp相對表達(dá)量分別為1.244、1.068及0.930。由此可以看出，大鼠海馬組織更容易檢測到P-gp，以下給予DBE、SDSS-B及SDSS后大鼠腦組織P-gp表達(dá)水平研究均優(yōu)選海馬組織進(jìn)行。

2.2.2 大鼠給予DBE及SDSS-B后海馬組織P-gp表達(dá) 大鼠給予DBE、SDSS-B、SDSS及溶媒后，其海馬組織的P-gp表達(dá)如Fig 5所示，DBE、SDSS-B給藥均能降低大鼠海馬組織P-gp表達(dá)量。以溶媒控制組P-gp相對表達(dá)量為100%，其他3種給藥方式下P-gp表達(dá)量的歸一化結(jié)果顯示，除給藥5 min外，DBE及SDSS-B在其他給藥間隔均可明顯降低P-gp表達(dá)(P<0.01)；而且DBE及SDSS-B組的P-gp表達(dá)均在給藥45 min時(shí)處于最低水平，分別達(dá)到(47.58±2.28)%和(46.54±1.41)%。然而，對于SDSS組而言，它對P-gp表達(dá)僅在給藥30 min可降至(93.23±2.73)% (P= 0.013)，其余給藥間隔并沒表現(xiàn)出明顯抑制作用(P>0.05)。此外，我們也注意到DBE與SDSS-B在某些給藥時(shí)段的P-gp表達(dá)有明顯差別，但兩者并無規(guī)律可循。如：給藥15 min時(shí)，SDSS-B給藥對P-gp抑制作用較DBE明顯[P=0.000, (70.31±2.14)%vs(88.81±1.12)%]；當(dāng)給藥延長至30 min或45 min,兩者P-gp表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。然而，當(dāng)給藥增至60 min時(shí)，DBE給藥對P-gp表達(dá)抑制作用更明顯[P=0.000, (85.04±1.42)%vs(95.29±0.98)%]。

Fig 2 MRM chromatograms of DSS and hydroxybenzoic acid in rat brain homogenate after administration of 15 min

A: DBE group; B: SDSS-B group; C: SDSS group

Fig 3 MRM chromatograms of DSS and hydroxybenzoic acid in rat brain homogenate after administration of 30 min

A: DBE group; B: SDSS-B group; C: SDSS group

Fig 4 P-gp Western blot image in different regions of rat brain

由以上給藥初期(15 min)DBE對P-gp表達(dá)量的抑制及降解DSS腦部分布均不如SDSS-B明顯、而給藥后期(30、45、60 min)DBE對P-gp表達(dá)量影響與SDSS-B相當(dāng)或遠(yuǎn)低于SDSS-B的變化趨勢?？梢酝茰y，DBE中真正發(fā)揮P-gp抑制作用的可能是降解得到的冰片，而非DBE本身。更進(jìn)一步的解釋還需結(jié)合給藥后各時(shí)間段DSS及冰片含量的變化趨勢來說明。

Fig 5 Expression of P-gp in rat hippocampus treated with DBE, SDSS-B and SDSS

**P<0.01vsSDSS;##P<0.01vsSDSS-B

3 討論

DBE是冰片與丹參素綴合而成的化合物，其可抑制β-淀粉樣蛋白(amyloid β, Aβ)聚集并具有神經(jīng)保護(hù)作用[14]，對三氯化鐵致大鼠中動(dòng)脈缺血具有保護(hù)作用[15]，是一種潛在的治療腦部疾病的藥物。本研究證實(shí)了DBE和SDSS-B相對于SDSS給藥均具有一定的腦部靶向作用。

藥物有無腦靶向性取決于藥物BBB通透性強(qiáng)弱，以及入腦藥物被外排出腦的難易程度。藥物脂溶性增大，其BBB通透性則強(qiáng)。將水溶性DSS改造為酯型DBE后其脂溶性增加，DBE更易跨越BBB到達(dá)腦部，致使腦內(nèi)可供降解為DSS的DBE量上升，這一推測在尾靜脈注射DBE 15 min或30 min后,其腦內(nèi)DSS分布量分別比直接注射SDSS中提高141%～154%得到證實(shí)。另一方面，BBB上存在具有外排作用的P-gp,可將入腦藥物外排出腦。因此，抑制P-gp表達(dá)、減弱P-gp外排泵效能有助于藥物實(shí)現(xiàn)腦靶向性。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用Western blot研究DBE、SDSS-B及SDSS對大鼠腦組織P-gp表達(dá)量的影響，以此分析上述藥物對P-gp的外排抑制作用。Western blot結(jié)果提示，DBE及SDSS-B二者均能抑制P-gp表達(dá)，這種抑制作用均強(qiáng)于SDSS；而SDSS對P-gp表達(dá)并無明顯抑制。由此可推測冰片對大鼠海馬P-gp表達(dá)應(yīng)具有抑制作用。

綜上所述，DBE及SDSS-B給藥均可有效降低腦組織中P-gp表達(dá)，這或許減弱了P-gp對DBE及分解DSS的外排轉(zhuǎn)運(yùn)，最終促使DBE及DSS在腦部蓄積，故LC-MS分析DBE給藥呈現(xiàn)出一定腦部靶向和緩釋作用。如從該層面分析，這種DBE前藥方式可能要優(yōu)于SDSS-B等摩爾聯(lián)合給藥。以上研究結(jié)果提示，在DSS結(jié)構(gòu)上引入P-gp抑制小分子可在一定程度上抑制腦組織P-gp表達(dá)水平，并促使DSS實(shí)現(xiàn)腦靶向作用，這也為其他藥物的腦靶向衍生物設(shè)計(jì)提供了一種設(shè)計(jì)思路和依據(jù)。不過DBE對腦組織P-gp外排功能的影響還需進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)均在合肥工業(yè)大學(xué)天然藥物研究所及安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝本學(xué)院神經(jīng)藥理學(xué)與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室何慧明碩士給予的技術(shù)支持。)

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Effect of Danshensu borneol ester on P-glycoprotein expression level in rat brain

ZHANG Zheng1, YANG Li1, ZHU Kai-li1, ZHOU An2, HUI Ai-ling1, ZHANG Wen-cheng1, WU Ze-yu1
(1.InstituteofNaturalMedicine,SchoolofFoodScienceandEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China;2.AnhuiProvinceKeyLabofResearchandDevelopmentofChineseMedicine,CollegeofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the relationship between the brain targeting effect and P-glycoprotein (P-gp) expression level of Danshensu borneol ester(DBE) and the combination use of sodium Danshensu and borneol(SDSS-B).Methods The liquid chromatography mass spectrometry(LC-MS) method was applied to investigate the accumulation of Danshensu(DSS) in rat brain tissues after intravenous injection of DBE, SDSS-B and SDSS. Also their effect on regulating the expression level of P-gp in rat hippocampus was investigated using Western blot.Results The brain targeting effect of DBE, SDSS-B was qualitatively analyzed through the brain distribution of DSS, and the result was DBE(SDSS-B)>SDSS(P<0.01). Meanwhile, the brain distribution of DBE group was slightly lower than SDSS-B group at 15 min, while at 30 min DBE was higher than that of SDSS-B. DBE demonstrated a better slow release property compared to SDSS-B. Western blot analysis indicated that DBE, SDSS-B were more effective in inhibiting the expression of P-gp than SDSS in rat hippocampus(P<0.01vscontrol or SDSS group), and the lowest P-gp expression was obtained with(47.58±2.28)% and (46.54±1.41)% at 45 min after administration of DBE or SDSS-B. Once the administration time was extended to 60 min, the inhibitory effect on P-gp expression of DBE was stronger than SDSS-B[(85.04±1.42)%vs(95.29±0.98)%].However, no significant inhibition of P-gp expression in rat hippocampus was found throughout the treatment of SDSS(P>0.05 at 5, 15, 45, 60 min,vscontrol group).Conclusion An attenuated expression level of P-gp can be realized by DBE and SDSS-B, which is advantageous to their brain targeting.

Danshensu; borneol; Danshensu borneol ester; drug combination; brain targeting; P-glycoprotein; Western blot

2017-05-03，

2017-06-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 21302037)；安徽省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(No 16030701072)

張 鄭(1992-)，男，碩士，研究方向：天然藥物開發(fā)，E-mail：591292290@qq.com； 惠愛玲(1980-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)、腦靶向分子設(shè)計(jì)，通訊作者，E-mail：haling@hfut.edu.cn

時(shí)間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.030.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.015

A

1001-1978(2017)08-1114-06

R-332；R282.71；R284.1；R322.81；R341.32；R977.6