黃連解毒湯對(duì)S180肉瘤、M VD及VEG F、M M P-9表達(dá)的影響

張夢(mèng)月，孫燕，于寧，李欣楠，馬積昊，楊曉竹

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級(jí)，遼寧沈陽(yáng)110034；2.物理學(xué)教研室；3.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心；4.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)）

黃連解毒湯對(duì)S180肉瘤、M VD及VEG F、M M P-9表達(dá)的影響

張夢(mèng)月1，孫燕2*，于寧1，李欣楠3，馬積昊4，楊曉竹1

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級(jí)，遼寧沈陽(yáng)110034；2.物理學(xué)教研室；3.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心；4.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)）

目的：研究黃連解毒湯對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其對(duì)腫瘤組織血管生長(zhǎng)相關(guān)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)及微血管密度（MVD）的影響。方法：將50只健康雌性小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組，黃連解毒湯大、中、小劑量組。建立小鼠S180肉瘤模型，對(duì)照組灌胃20 ml/kg生理鹽水，環(huán)磷酰胺組灌胃25 mg/kg環(huán)磷酰胺；黃連解毒湯大、中、小劑量組分別灌胃22.0、11.0、5.5 g/kg黃連解毒湯，觀察抑瘤率，并采用免疫組化的方法研究黃連解毒湯對(duì)腫瘤組織VEGF、MVD、MMP-9的作用。結(jié)果：黃連解毒湯大劑量組對(duì)小鼠S180肉瘤具有明顯的抑制作用，免疫組化染色顯示黃連解毒湯可明顯下調(diào)VEGF、MMP-9的表達(dá)，同時(shí)對(duì)腫瘤組織的MVD有明顯抑制作用。結(jié)論：黃連解毒湯可通過(guò)抑制VEGF及MMP-9的表達(dá)來(lái)抑制血管的生成從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

黃連解毒湯；S180肉瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微血管密度；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

黃連解毒湯出自《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，是清熱解毒代表方劑。該方具有明顯抑制惡性腫瘤的作用［1］。但黃連解毒湯抗腫瘤作用機(jī)制研究較少，現(xiàn)有研究主要集中在其影響細(xì)胞增殖能力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面［2-3］。亦有研究表明黃連解毒湯能增強(qiáng)荷瘤小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的殺傷功能及體液免疫功能［4］。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯抗腫瘤作用可能與抗腫瘤血管生成有關(guān)［5］。在此基礎(chǔ)上我們采用S180移植性腫瘤模型，觀察了黃連解毒湯對(duì)S180的抑制作用，同時(shí)觀察了其對(duì)腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討黃連解毒湯抑瘤作用與血管生成的關(guān)系，為其抗腫瘤機(jī)制研究提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物黃連解毒湯：黃連、黃芩、黃柏，梔子均購(gòu)于沈陽(yáng)市藥材公司，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥鑒定教研室專家鑒定為正品；陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺，通化茂祥制藥有限公司出品，批號(hào)120301；VEGF一抗，Santa Cruz產(chǎn)品；鼠抗人CD34單克隆抗體、超敏S-P（鼠/兔）試劑盒、MMP-9一抗、DAB顯色試劑盒均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 動(dòng)物與瘤株健康雌性昆明種小鼠，體重18～22 g，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：遼實(shí)動(dòng)字（2000）第042號(hào)。腹水型S180瘤株購(gòu)自于吉林省腫瘤研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃連解毒湯藥液制備黃連、黃芩、黃柏、梔子按原方重量比（3∶2∶2∶3）煎煮2次，分別加10倍、8倍的水煎煮60、40 min，合并煎煮液，濃縮至含生藥1.4 g/ml，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2動(dòng)物分組將50只健康雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為對(duì)照組，灌胃生理鹽水，用量20 ml/kg；環(huán)磷酰胺組，用量25 mg/ kg；黃連解毒湯大、中、小劑量組，22.0、11.0、5.5 g/kg。黃連解毒湯大、中、小劑量組分別相當(dāng)于60 kg成人日用量的4、2、1倍。

1.2.3 瘤株移植方法及給藥S180腹水瘤細(xì)胞株經(jīng)昆明種小白鼠腹腔移植傳代，取傳代7 d的小鼠，無(wú)菌操作，從腹腔抽取腹水瘤細(xì)胞液，用生理鹽水調(diào)至1×107個(gè)/ml，每鼠于右前腋下接種0.2 ml。接種次日開(kāi)始給藥，每日1次，CTX組小鼠體重減輕后改為隔日給藥，用藥7 d。

1.2.4 腫瘤組織免疫組化染色用藥后7 d各組小鼠均于末次給藥后1 h進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：稱重后，脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，精密電子天平稱重。新鮮的腫瘤組織做冰凍切片，厚8μm，用于VEGF、MVD、MMP-9免疫組化，步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，VEGF、MVD、MMP-9一抗均為1∶100稀釋。

1.3 觀察指標(biāo)及觀察方法

1.3.1 抑瘤率抑瘤率（%）=（對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.3.2 腫瘤組織VEGF、MVD、MMP-9免疫組化測(cè)定VEGF免疫組化染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Rahman等方法［6］進(jìn)行，即染色評(píng)分=著色細(xì)胞的比例評(píng)分（染色范圍）+染色的強(qiáng)度評(píng)分。染色范圍（陽(yáng)性細(xì)胞比率）分為0～4級(jí)：0分，陰性；1分，陽(yáng)性細(xì)胞1%～25%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞26%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞76%～100%。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)劃分為0～3級(jí)：0分，陰性；1分，弱陽(yáng)性；2分，中等強(qiáng)度；3分，強(qiáng)陽(yáng)性。

MVD的測(cè)定（CD34陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)）按何振輝［7］的方法，凡是染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，凡管腔有較厚肌層包繞或管腔內(nèi)紅細(xì)胞＞8個(gè)的血管區(qū)域不予計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：先于100倍視野內(nèi)選取3個(gè)血管高密度的區(qū)域，再轉(zhuǎn)到200倍視野計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的血管數(shù)量，取3個(gè)數(shù)值的平均值作為微血管密度。

MMP-9檢測(cè)參照陳雷等［8］的方法給予評(píng)分，將切片置于載物臺(tái)上，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（物鏡40×），根據(jù)細(xì)胞膜或漿的染色程度及染色細(xì)胞的百分比分析評(píng)分，即評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：最后得分=每張切片著色度得分×著色細(xì)胞百分比得分。著色度得分：基本不著色為0分；著色淡為1分；著色適中為2分；著色較深為3分。著色細(xì)胞百分比得分：著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；≥51%為3分；最后總分得0～1分，評(píng)為陰性（－）；2～3分，評(píng)為弱陽(yáng)性（+）；4～5分，評(píng)為中陽(yáng)性（++）；≥6分，評(píng)為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件，所有計(jì)量資料采用（x±s）表示，采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；兩等級(jí)資料比較用Mann－Whitney-U秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響S180荷瘤小鼠經(jīng)藥物處理7 d后，取腫瘤組織稱重，結(jié)果表明，CTX組和黃連解毒湯各劑量組小鼠的瘤重均小于對(duì)照組。其中，CTX組與黃連解毒湯大劑量組對(duì)小鼠S180肉瘤瘤重具有明顯的抑制作用（P＜0.01，P＜0.05）。且與CTX組相比，黃連解毒湯大、中劑量組小鼠飲食、毛色、精神狀況明顯較優(yōu)，見(jiàn)表1。

表1 黃連解毒湯對(duì)S180荷瘤小鼠實(shí)體瘤的抑制作用（x±s，n=10）

2.2 黃連解毒湯對(duì)S180腫瘤組織中VEGF表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，VEGF主要定位于S180腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，且在S180腫瘤組織中呈高表達(dá)，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，CTX對(duì)VEGF表達(dá)無(wú)顯著影響，而黃連解毒湯小劑量組有下調(diào)VEGF表達(dá)的趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），大、中劑量組對(duì)VEGF表達(dá)有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

2.3 黃連解毒湯對(duì)S180腫瘤組織中MVD的影響免疫組化染色后，鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色，對(duì)照組可見(jiàn)微血管廣泛分布于組織間質(zhì)內(nèi)，與對(duì)照組比較，CTX組與黃連解毒湯各劑量組MVD均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）。見(jiàn)表2和圖2。

表2 黃連解毒湯對(duì)S180肉瘤VEGF表達(dá)和MVD的影響（x±s，n=10）

圖2 免疫組化染色檢測(cè)MVD（×200）

2.4 黃連解毒湯對(duì)S180腫瘤組織中MMP-9表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)染色顯示，MMP-9主要定位于S180腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜也可見(jiàn)染色，呈棕黃色，且在S180腫瘤組織中呈高表達(dá)。與對(duì)照組相比，黃連解毒湯中、大劑量組陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）；Mann-Whitney-U秩和檢驗(yàn)同樣顯示，黃連解毒湯可使MMP-9表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。

3 討論

腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中需要豐富的血供，這就要求大量腫瘤血管新生。腫瘤血管生成是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程，是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，抗腫瘤血管生成就是針對(duì)腫瘤血管生成過(guò)程中某些因子及其關(guān)鍵步驟進(jìn)行抑制和干擾，從而減少或抑制腫瘤的血管生成。血管新生在體內(nèi)受一系列因子調(diào)節(jié)，其中以VEGF最為重要，它是維持血管功能和腫瘤擴(kuò)增的關(guān)鍵因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移甚至改變其基因表達(dá)，還能增加微血管的通透性。VEGF可能在多種血管生長(zhǎng)因子中起到中心調(diào)控作用［9］，并已成為抗腫瘤血管生成治療的靶點(diǎn)［10］。本研究中，CTX對(duì)VEGF的表達(dá)無(wú)顯著作用，可能是劑量原因。而黃連解毒湯大、中劑量組對(duì)VEGF的表達(dá)有明顯的抑制作用，說(shuō)明抗血管生成可能是黃連解毒湯抗腫瘤作用的重要機(jī)制。

表3 黃連解毒湯對(duì)S180肉瘤MMP-9表達(dá)的影響（x±s，n=10）

圖3 免疫組化染色檢測(cè)MMP-9的表現(xiàn)（×400）

MVD能較為準(zhǔn)確地反映腫瘤內(nèi)的血管狀態(tài)，是一種反映腫瘤血管形成程度的量化指標(biāo)，目前MVD已被公認(rèn)為是預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)，它與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯各劑量組均有明顯抑制MVD作用，提示黃連解毒湯可通過(guò)降低MVD來(lái)發(fā)揮抑瘤作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）是一大類鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，能降解一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)，參與結(jié)締組織的降解和重建、炎癥反應(yīng)、腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移以及缺血缺氧損傷等。研究表明MMPs在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用［12］。其中MMP-9被認(rèn)為是與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲性關(guān)系最密切的金屬蛋白酶［13-14］。本研究表明，黃連解毒湯對(duì)MMP-9的表達(dá)具有明顯的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯大、中、小劑量組小鼠的瘤重均小于對(duì)照組，其中黃連解毒湯大劑量組對(duì)小鼠S180肉瘤具有明顯的抑制作用。雖然其對(duì)S180腫瘤的抑瘤率不及CTX強(qiáng)，但與CTX組相比，黃連解毒湯大、中劑量組小鼠飲食、毛色、精神狀況明顯優(yōu)于CTX組，說(shuō)明黃連解毒湯在抑制腫瘤的同時(shí)，可提高小鼠的生存質(zhì)量。

綜上所述，黃連解毒湯可能通過(guò)降低腫瘤組織中的MVD，并下調(diào)VEGF及MMP-9的表達(dá)水平來(lái)抑制腫瘤血管生成。

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In h i b i t o r yEf f e c t s o f H u a n g l i a n j i e d uD e c o c t i o no nS180Sa r c o ma,M VD a n dt h e Ex p r e s s i o no f VEG F a n d M M P-9

ZHANG Mengyue1，SUN Yan2*，YU Ning1，LI Xinnan3，MA Jihao4，YANG Xiaozhu1
（1.Grade 2012，Shenyang Medical College,Shenyang 110034，China；2.Department of Pharmacology；3.Liaoning Province Animal Feed Quality and Safety of Veterinary Testing Centers；4.Grade 2011,He University）

O b j e c t i v e：To study the antitumor activity of Huanglianjiedu Decoction in vivo and the inhibitory effects on microvessel density（MVD）and the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）.Methods：A total of 50 healthy female Kunming mice（18-22 g）were randomly divided into 5 equal groups：control group，CTX positive group and Huanglianjiedu Decoction high，medium and low dose groups.S180tumor-bearing mice-model was established by the inoculation of 0.2 ml S180cell suspension subcutaneously.The control group was gavaged by normal saline,the CTX positive group was gavaged by CTX at a dose of 25 mg/kg，the high，medium and low dose Huanglianjiedu Decoction group was gavaged by Huanglianjiedu Decoction at a dose of 22，11，5.5 g/kg.Immunohistochemical method was performed to detect MVD and the expression of VEGF and MMP-9.Results：Compared with the control group，high dose Huanglianjiedu Decoction group significantly inhibited tumor growth with the rate up to 41.69%，which was similar to CTX positive group.The expression of VEGF and MMP-9 were also inhibited by Huanglianjiedu Decoction.And MVD were also markedly reduced after Huanglianjiedu Decoction treatment.Conclusion：One of the antitumor mechanisms of Huanglianjiedu Decoction may be the angiogenesis inhibitory activity by inhibiting the expression of VEGF and MMP-9.

Huanglianjiedu Decoction；S180sarcoma；VEGF；MVD；MMP-9

R285

A

1008-2344（2017）02-0178-04

2016-01-28

（吳迪編輯）

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目（No.20151020）

孫燕（1979—），女（漢），博士，講師，研究方向：中藥藥理學(xué).E-mail：inksun@163.com

d o i：10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.032