微生物被膜形成因子及其對厚殼貽貝附著的影響

高偉,郭行磐,徐嘉康,彭莉華,沈和定,楊金龍、2,梁簫、2

(1.上海海洋大學水產(chǎn)種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室,上海201306;2.海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學),科學技術部,上海201306)

微生物被膜形成因子及其對厚殼貽貝附著的影響

高偉1,郭行磐1,徐嘉康1,彭莉華1,沈和定1,楊金龍1、2,梁簫1、2

(1.上海海洋大學水產(chǎn)種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室,上海201306;2.海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學),科學技術部,上海201306)

為調(diào)查環(huán)境因子對微生物被膜形成能力的影響以及在此條件下形成的微生物被膜對厚殼貽貝Mytilus coruscus稚貝(殼長為1.81 mm±0.13 mm)附著的影響,通過顯微共聚焦技術和熒光染色技術,探討了在18℃條件下鹽度為10、20、30時和鹽度為30的條件下溫度為8、18、28℃時,環(huán)境因子對希瓦氏細菌Shewanella loihica ECSMB14101形成微生物被膜產(chǎn)生的影響,調(diào)查了上述環(huán)境下形成微生物被膜的細菌密度、分布、膜厚等生物學特性及其對厚殼貽貝稚貝附著的影響。結果表明：S.loihica ECSMB14101形成微生物被膜的最終密度隨鹽度的升高而增加;不同密度的微生物被膜誘導活性不同,且與鹽度呈線性關系;微生物被膜上細菌密度隨溫度的升高而增多,在8℃和18℃時對稚貝的附著誘導活性有顯著性差異(P＜0.05),附著率分別為31%和68%,18℃與28℃時的微生物被膜誘導活性無顯著性差異(P＞0.05);隨鹽度和溫度的上升,微生物被膜上的細菌分布逐漸密集,膜厚顯著增加,且在鹽度為30、溫度為28℃條件下微生物被膜的膜厚達到最大值(4.4 μm±0.1 μm);在溫度為18℃、鹽度為30條件下,膜厚的最大值為(4.3±0.1)μm。研究表明,鹽度和溫度改變微生物被膜的生物學特性,并導致貽貝附著率的顯著差異。

環(huán)境因子;微生物被膜;厚殼貽貝;稚貝;附著

厚殼貽貝Mytilus coruscus是一種十分重要的海洋經(jīng)濟貝類,廣泛分布于朝鮮、日本及中國黃、渤海和東海等沿岸[1]。厚殼貽貝的生活史經(jīng)歷兩個主要階段,分別是浮游生活階段和附著生活階段[2]。厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的成功與否直接影響其后的正常發(fā)育和健康生長,從而決定了貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益與發(fā)展前景[3]。

微生物被膜是地球上分布最廣和最為成功的生命模式之一[4],幾乎存在于海洋環(huán)境中的所有附著基表面,其形成受營養(yǎng)條件、附著基質特性等諸多因素影響[5-8]。孫俊杰等[8]研究表明,營養(yǎng)鹽變化可導致海洋細菌形成的微生物被膜形態(tài)、分布和蛋白含量發(fā)生改變。Lau等[9]發(fā)現(xiàn),溫度和鹽度的變化會影響自然微生物被膜的細菌群落結構、細菌密度和總生物量。微生物被膜在生物地球化學循環(huán)過程及海洋無脊椎動物附著過程中發(fā)揮了關鍵性調(diào)控作用[10-11]。大量研究表明,自然微生物被膜、單一細菌形成的微生物被膜均能在不同程度上影響厚殼貽貝稚貝的附著過程[12-15]。

希瓦氏細菌屬Shewanella于1985年首次被鑒定為新屬[16],隸屬于變形菌門、γ-變形菌綱,為廣泛分布于海洋和淡水環(huán)境中的兼性厭氧菌[17]。由于其不同代謝特性,希瓦氏細菌屬現(xiàn)已成為研究碳循環(huán)和生態(tài)環(huán)境修復的模式菌[17]。與此同時,自然微生物被膜中分離出的希瓦氏菌屬Shewanella spp.能促進厚殼貽貝的幼蟲附著變態(tài),且希瓦氏細菌微生物被膜中的兩種化學信號參與調(diào)控了幼蟲附著變態(tài)的發(fā)育過程[18],也能促進厚殼貽貝的稚貝附著[14]。與以上研究相比,環(huán)境因子對單一細菌形成的微生物被膜形成及其對厚殼貽貝附著的影響研究尚且較少。本試驗中,以厚殼貽貝和希瓦氏菌屬Shewanella loihica ECSMB14101[19]為研究對象,調(diào)查了不同溫度和鹽度對微生物被膜形成及其對稚貝附著的影響,旨在探索環(huán)境因子、微生物被膜形成和貽貝附著三者間的相互關系,為解析貽貝附著分子機制及稚貝的中間培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用海洋細菌S.loihica ECSMB14101分離于自然微生物被膜并冷凍保存(-80℃)。試驗用稚貝采自浙江嵊泗養(yǎng)殖場,稚貝帶回實驗室暫養(yǎng)1周后進行附著試驗。暫養(yǎng)條件：水溫為18℃,無光照,持續(xù)充氣;每天換水并投喂金藻Isochrysis galbana。附著試驗所用稚貝殼長為(1.81±0.13) mm、殼高為(1.13±0.08)mm。

1.2 方法

1.2.1 微生物被膜的制備 參考楊金龍等[20]的方法制備被膜。挑取保種S.loihica ECSMB14101到100 mL ZoBell 2216E液體培養(yǎng)基中,在200 r/min、25℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h,去上清收集細菌,加入適量滅菌過濾海水(Autoclaved filtered seawater,AFSW),混勻后即制成細菌懸浮液。以0.22 μm濾膜過濾,然后用0.1%吖啶橙溶液染色5 min,在熒光顯微鏡(奧林巴斯BX51,1000倍)下取10個隨機視野計數(shù),得出細菌總密度。鹽度30組微生物被膜形成時,培養(yǎng)皿中添加細菌懸浮液,用AFSW定容至20 mL,初始細菌密度為1× 108CFU/mL,分別放在8、18、28℃、無光照條件下培養(yǎng)48 h;溫度18℃組微生物被膜形成時,培養(yǎng)皿中添加細菌懸浮液,用AFSW定容至20 mL,終鹽度分別為10、20、30,初始細菌密度為1×108CFU/mL,18℃、無光照條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細菌密度計數(shù) 微生物被膜經(jīng)5%甲醛溶液固定,用0.1%吖啶橙染色,5 min后用熒光顯微鏡觀察取10個隨機視野計數(shù),以確定形成的微生物被膜密度。試驗設3個平行組,其計算公式參考楊金龍等[20]方法。

1.2.3 微生物被膜形態(tài)及厚度分析 微生物被膜經(jīng)5%甲醛溶液固定,24 h后用5 μg/mL的碘化丙啶溶液在黑暗條件下染色15 min,激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy, CLSM,630×)下拍照。試驗設置3個平行組,每組隨機選10個視野用于成像和分析。

1.2.4 稚貝附著試驗 厚殼貽貝稚貝附著試驗及附著率計算參照楊金龍等[20]的方法。將一片附有微生物被膜的玻片作為附著基放入無菌培養(yǎng)皿(64 mm×19 mm)中,并加入20 mL ASFW,再將10只稚貝放入培養(yǎng)皿中,在18℃和無光照條件下于6、12、24、48 h時記錄并計算稚貝在微生物被膜上的附著率。每組設9個平行,以無微生物被膜的載玻片為空白對照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果用JMP 10.0.0軟件進行差異統(tǒng)計分析和相關性檢驗。稚貝附著率和細菌密度的相關性使用Spearman'多元分析方法進行分析,顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同環(huán)境因子下微生物被膜的密度變化

從圖1可見：在鹽度30條件下,隨著溫度的上升,S.loihica ECSMB14101形成的微生物被膜的終密度顯著增加,8、18、28℃時,微生物被膜的終密度分別為1.9×107、2.6×107、3.6×107cells/cm2;在溫度18℃條件下,隨著鹽度的升高, S.loihica ECSMB14101形成的微生物被膜的終密度也逐漸增加,鹽度為10、20、30時,微生物被膜的終密度分別為0.6×107、1.2×107、2.3×107cells/cm2。作為環(huán)境因子的溫度和鹽度,均與微生物被膜細菌終密度顯著相關(P＜0.05)(表1)。

圖1 不同環(huán)境因子下形成希瓦氏菌ECSMB14101微生物被膜的密度變化Fig.1 Density of Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms under different environmental factors

2.2 微生物被膜厚度和形態(tài)

隨著溫度的升高,S.loihica ECSMB14101形成的微生物被膜分布越來越密集,細菌數(shù)量越來越多(圖2-A);同時,微生物被膜膜厚顯著增加(P＜0.05)(圖2-B),且在28℃時微生物被膜的膜厚最大,為(4.4±0.1)μm。隨著鹽度的不斷升高, S.loihica ECSMB14101微生物被膜也更加密集(圖3-A),同時,S.loihica ECSMB14101微生物被膜的膜厚顯著增厚(P＜0.05)(圖3-B),且在鹽度為30時膜厚最大值達到(4.3±0.1)μm。

表1 環(huán)境因子與Shewanella loihica ECSMB14101微生物被膜細菌密度、膜厚和誘導活性的相關性分析Tab.1 Correlation analysis between environmental factors and bacterial density,thickness and inducing activity of Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms

圖2 激光共聚焦測定溫度影響下希瓦氏菌ECSMB14101微生物被膜圖像(A)及膜厚(B)Fig.2 CLSM reveals micrographs(A)and thickness (B)of Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms at varying temperatures

圖3 激光共聚焦測定鹽度影響下希瓦氏菌ECSMB14101微生物被膜圖像(A)及膜厚(B)Fig.3 CLSM reveals micrographs(A)and thickness (B)of Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms at varying salinities

2.3 不同溫度和鹽度條件下微生物被膜對稚貝附著的影響

由于12 h后稚貝在微生物被膜上的附著率基本穩(wěn)定,因此,本研究中僅列出12 h時的試驗結果(圖4)。溫度試驗中,在鹽度為30時,對照組稚貝的附著率為10.0%±2.3%,微生物被膜試驗組與對照組存在顯著性差異(P＜0.05);18℃時稚貝附著率較8℃時顯著升高(P＜0.05),但與28℃時無顯著性差異(P＞0.05)。鹽度試驗中,在溫度為18℃時,對照組稚貝的附著率最低;隨著鹽度的不斷升高,S.loihica ECSMB14101微生物被膜對稚貝附著的誘導活性顯著升高(P＜0.05)。

圖4 不同環(huán)境因子影響下希瓦氏菌ECSMB14101微生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響Fig.4 Percentages of settlement of plantigrades of mussel Mytilus coruscus on Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms under different environmental factors

2.4 微生物被膜終密度與稚貝附著率的關系

由圖5可知,S.loihica ECSMB14101微生物被膜上的細菌密度變化影響厚殼貽貝稚貝附著的誘導活性。隨著細菌密度的逐漸升高,微生物被膜對厚殼貽貝稚貝的誘導活性明顯增加(P＜0.05)。

圖5 厚殼貽貝稚貝附著與希瓦氏菌ECSMB14101微生物被膜終密度的關系Fig.5 Interaction between settlement rate of plantigrades of mussel Mytilus coruscus and cells density of Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms under different environmental factors

3 討論

3.1 鹽度和水溫對微生物被膜形成及微生物被膜對厚殼貽貝附著的影響

前期研究發(fā)現(xiàn),鹽度影響多種微生物形成的微生物被膜的干質量、葉綠素a含量、細菌密度和群落結構等,進而影響厚殼貽貝的附著[5]。本試驗結果表明,隨著溫度和鹽度的不斷升高,S.loihica ECSMB14101微生物被膜中的細菌密度、分布和膜厚等生物學特性顯著改變,表明鹽度和溫度的變化影響了微生物被膜的形成和細菌密度。以往在溫度和鹽度對自然微生物被膜形成的影響研究與本研究結果相同[9]。本研究中發(fā)現(xiàn),隨鹽度的升高,形成的S.loihica ECSMB14101微生物被膜的附著誘導活性也隨之升高。推測鹽度影響了微生物被膜形成,同樣還發(fā)現(xiàn),隨溫度的升高,形成的S.loihica ECSMB14101微生物被膜對厚殼貽貝稚貝的附著率也隨之升高,且在18℃時保持穩(wěn)定。因此,微生物被膜的生物學特性影響稚貝的附著行為。

微生物被膜中細菌密度的高低影響其群落結構及功能的行使,如細菌分泌群體感應信號分子調(diào)控魷魚發(fā)光,只有細菌密度達到一定閾值時才能夠發(fā)光[21]。微生物被膜中細菌的密度影響著海洋貽貝類的附著[13-14]。對華美盤管蟲Hydroides elegans幼蟲附著變態(tài)過程的研究發(fā)現(xiàn),微生物被膜中細菌的終密度隨細菌初始密度的增加而增加,并且細菌密度也與幼蟲的附著率呈正相關趨勢[22]。同樣,微生物被膜中細菌密度與厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)相關[23]。本試驗中發(fā)現(xiàn)：不同鹽度和溫度條件下,形成的微生物被膜對稚貝附著的誘導活性與細菌密度顯著相關;同時還發(fā)現(xiàn),在相對較低的溫度(8、18℃)時,S.loihica ECSMB14101微生物被膜對稚貝的誘導活性顯著增加,但18℃與28℃時形成微生物被膜對稚貝的誘導活性無顯著性差異。這可能是由于溫度變化能影響到微生物被膜的形成,改變特定的生物學特性,但存在閾值效應,這需要進一步研究驗證。

3.2 細菌種屬與微生物被膜形成以及厚殼貽貝附著的相互關系

由不同種屬細菌形成的微生物被膜對海洋無脊椎動物的附著也不盡相同,其原因可能與微生物分泌的代謝產(chǎn)物相關[20]。本研究中選取的S.loihica ECSMB14101形成的微生物被膜已被證實能夠對厚殼貽貝幼蟲和稚貝的附著具有極好的誘導活性[14,18],且二者均與該菌釋放的水溶性代謝產(chǎn)物及微生物被膜表面活性物質相關。為適應環(huán)境,浮游的細菌會形成微生物被膜以抵御外界環(huán)境的變化,Shewanella spp.的細菌亦是如此[24],且在不同環(huán)境條件下微生物被膜釋放的代謝產(chǎn)物不同。

本試驗中首次證實了溫度和鹽度能夠調(diào)控單一細菌微生物被膜的形成過程,且在適宜條件下形成的微生物被膜能夠有效誘導海產(chǎn)貝類厚殼貽貝稚貝的附著。

[1] 常亞青.貝類增養(yǎng)殖學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[2] 李太武.海洋生物學[M].北京：海洋出版社,2013.

[3] 孫俊杰,張顯,郭行磐,等.硅烷化表面海洋細菌對厚殼貽貝稚貝附著的影響[J].水產(chǎn)學報,2015,39(10)：1530-1538.

[4] Stoodley P,Sauer K,Davies D G,et al.Biofilms as complex differentiated communities[J].Annual Review of Microbiology,2002, 56：187-209.

[5] Yang J L,Li Y F,Liang X,et al.Silver nanoparticles impact biofilm communities and mussel settlement[J].Scientific Reports, 2016,6：37406.

[6] Yang J L,Li Y F,Guo X P,et al.The effect of carbon nanotubes and titanium dioxide incorporated in PDMS on biofilm community composition and subsequent mussel plantigrade settlement[J].Biofouling,2016,32(7)：763-777.

[7] Yang J L,Zhou X,Li Y F,et al.Plantigrade settlement of the mussel Mytilus coruscus in response to natural biofilms on different surfaces[J].Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom,2014,94(8)：1639-1649.

[8] 孫俊杰,梁簫,郭行磐,等.培養(yǎng)基對微生物被膜形成和厚殼貽貝附著的影響[J].水產(chǎn)學報,2016,40(8)：1229-1238.

[9] Lau S C K,Thiyagarajan V,Cheung S C K,et al.Roles of bacterial community composition in biofilms as a mediator for larval settlement of three marine invertebrates[J].Aquatic Microbial Ecology, 2005,38(1)：41-51.

[10] Flemming H C,Wingender J,Szewzyk U,et al.Biofilms：an emergent form of bacterial life[J].Nature Reviews Microbiology, 2016,14(9)：563-575.

[11] 楊金龍,王沖,顧忠旗,等.微生物膜對海洋無脊椎動物幼體附著變態(tài)的影響研究[J].海洋科學,2012,36(8)：116-121.

[12] 楊金龍,李響,王沖,等.低鹽度形成的微生物膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響[J].海洋科學,2013,37(8)：107-113.

[13] Yang J L,Li X,Liang X,et al.Effects of natural biofilms on settlement of plantigrades of the mussel Mytilus coruscus[J].Aquaculture,2014,424-425：228-233.

[14] Li Y F,Guo X P,Yang J L,et al.Effects of bacterial biofilms on settlement of plantigrades of the mussel Mytilus coruscus[J].Aquaculture,2014,433：434-441.

[15] 周軒,郭行磐,陳芋如,等.低濕度表面的海洋附著細菌對厚殼貽貝附著的影響[J].大連海洋大學學報,2015,30(1)：30-35.

[16] MacDonell M,Colwell R R.Phylogeny of the Vibrionaceae,and recommendation for two new genera,Listonella and Shewanella [J].Systematic and Applied Microbiology,1985,6(2)：171-182.

[17] Fredrickson J K,Romine M F,Beliaev A S,et al.Towards environmental systems biology of Shewanella[J].Nature Reviews Microbiology,2008,6(8)：592-603.

[18] Yang J L,Shen P J,Liang X,et al.Larval settlement and metamorphosis of the mussel Mytilus coruscus in response to monospecific bacterial biofilms[J].Biofouling,2013,29(3)：247-259.

[19] Yang J L,Guo X P,Ding D W.Draft genome sequence of Shewanella sp.ECSMB14101,isolated from the East China Sea[J]. Genome Announcement,2015,3(1)：e01388-14.

[20] 楊金龍,郭行磐,陳芋如,等.中濕度表面的海洋細菌對厚殼貽貝稚貝附著的影響[J].水產(chǎn)學報,2015,39(3)：421-428.

[21] Ruby E G,Lee K H.The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ association：current ecological paradigms[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64(3)：805-812.

[22] Huang S Y,Hadfield M G.Composition and density of bacterial biofilms determine larval settlement of the polychaete Hydroides elegans[J].Marine Ecology Progress Series,2003,260：161-172.

[23] Wang C,Bao W Y,Gu Z Q,et al.Larval settlement and metamorphosis of the mussel Mytilus coruscus in response to natural biofilms[J].Biofouling,2012,28(3)：249-256.

[24] Zeng Z S,Liu X X,Yao J Y,et al.Cold adaptation regulated by cryptic prophage excision in Shewanella oneidensis[J].The ISME Journal,2016,10(12)：2787-2800.

Effects of environmental factors on formation of bacterial biofilms and settlement of plantigrades of mussel Mytilus coruscus

GAO Wei1,GUO Xing-pan1,XU Jia-kang1,PENG Li-hua1, SHEN He-ding1,YANG Jin-long1,2,LIANG Xiao1,2
(1.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Ministry of Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China;2.International Research Center for Marine Biosciences at Shanghai Ocean University,Ministry of Science and Technology,Shanghai 201306, China)

Effects of water temperature(8,18 and 28℃)and salinity of 10,20,and 30 on Shewanella loihica ECSMB14101 biofilms and subsequent effect on settlement of plantigrades of mussel Mytilus coruscus with shell length of(1.81±0.13)mm were studied.The confocal laser scanning microscopy technique was used to investigate the characteristics of biofilms including biofilm thickness and the distribution of bacteria in biofilms.The results showed that the final density and thickness of the ECSMB14101 biofilm were increased with increase in temperature and salinity,with the maximal thickness of(4.4±0.1)μm at a salinity of 30 and at temperature of 28℃. The settlement inducing activities of the biofilms were different under different conditions of temperatures and salinities.The amount of bacteria in the biofilm was found to be increased with the increasing temperature,and the mussel had settlement rate of 31%at 8℃and 68%at 18℃,with significant difference(P＜0.05).In contrast, there was no significant difference in inducing activity at 18℃and 28℃(P＞0.05).The findings explored the interplay between environmental factors,biofilm formation,and settlement of mussel plantigrades.

environmental factor;biofilm;Mytilus coruscus;plantigrade of mussel;settlement

S968.3

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.04.005

2095-1388(2017)04-0405-05

2016-12-01

國家自然科學基金資助項目(41476131);上海市教委創(chuàng)新重點項目(14ZZ143);上海高校水產(chǎn)高峰學科建設項目

高偉(1991—),男,碩士研究生。E-mail：m140150331@st.shou.edu.cn

梁簫(1983—),女,博士,講師。E-mail：x-liang@shou.edu.cn