枸杞多糖對腦出血大鼠神經(jīng)細胞凋亡及凝血酶受體-1表達的影響

鄒有瑞，霍國進，王軍成，吳 橋，沈 冰

·論 著·

枸杞多糖對腦出血大鼠神經(jīng)細胞凋亡及凝血酶受體-1表達的影響

鄒有瑞1，霍國進2，王軍成3，吳 橋3，沈 冰1

目的 觀察枸杞多糖(LBP)對大鼠腦出血(ICH)后神經(jīng)細胞凋亡及凝血酶受體-1(PAR-1)表達的影響，并探討其可能機制。方法 將72只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、LBP低劑量、中劑量、高劑量組(50、100、200 mg/kg)和尼莫地平組10 mg/kg。各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積生理鹽水替代，1 次/d，共15 d。灌胃結(jié)束后，采用二次自體血注入法建立ICH模型；采用TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡，采用Western Blot、免疫組化、qRT-PCR，從不同水平探索LBP對ICH后腦組織PAR-1表達的影響。結(jié)果 模型組神經(jīng)細胞凋亡率、PAR-1陽性率、PAR-1蛋白的表達及PAR-1 mRNA的表達較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)，LBP各劑量組神經(jīng)細胞凋亡率、PAR-1陽性率、PAR-1蛋白的表達、PAR-1 mRNA的表達較模型組均有不同程度的減低(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，ICH后神經(jīng)細胞凋亡率與PAR-1陽性率呈正相關(guān)性。結(jié)論 LBP能夠抑制大鼠ICH引起的神經(jīng)細胞凋亡，對ICH后腦組織具有保護作用，其機制可能與抑制PAR-1表達有關(guān)。

枸杞多糖；腦出血；細胞凋亡；凝血酶受體-1

腦出血(ICH)占急性腦血管病的20%～30%，其死亡率和病殘率均較高，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。ICH的病理生理機制復(fù)雜，ICH后繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷的重要因素。最新研究表明，細胞凋亡在其中扮演著重要角色[2]。此外，凝血酶也在其中起著關(guān)鍵作用，它可以作用于腦組織內(nèi)凝血酶受體-1(PAR-1)而發(fā)揮細胞毒性作用[3]。枸杞多糖(LBP) 是我國傳統(tǒng)名貴中藥枸杞的主要活性成分。最新研究證實，LBP具有減輕腦組織缺血再灌注損傷、降低氧自由基損傷、保護神經(jīng)細胞、抑制神經(jīng)元凋亡、改善學(xué)習(xí)記憶能力等功能[4-5]，這些研究主要集中在腦缺血、糖尿病等方面，但在ICH領(lǐng)域的相關(guān)研究罕見報道。本研究將觀察LBP對ICH后神經(jīng)細胞凋亡及PAR-1表達的影響，并探討其可能機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠72只，體重(200±30)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(寧)2500-001],符合實驗動物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑：LBP(銀川泰豐生物科技有限公司，批號：G20140917,含量>32%)，全蛋白提取試劑盒，BCA蛋白含量檢測試劑盒，兔抗鼠PAR-1 抗體(abcam 公司)，山羊抗兔熒光二抗(Proteintech公司)，免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，TUNEL試劑盒(Roche公司)，Trizol(ambion公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo 公司)，Maxima SYBR Green/Pox qPCR Master Mix(2×)(Thermo公司)。

1.3 主要儀器：Narishige腦立體定位儀，分析天平(Mettler Toledo)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek)，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey)，實時熒光定量PCR儀，低溫離心機(Eppendorf)，石蠟切片機(Thermo),熒光顯微鏡(Olympus)，普通顯微鏡 (Olympus)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與給藥：將健康雄性SD大鼠72只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、LBP低劑量組(50 mg/kg)、LBP中劑量組(100 mg/kg)、LBP高劑量組(200 mg/kg)、尼莫地平組(10 mg/kg)，每組12只。各大鼠給予相應(yīng)劑量的藥物連續(xù)灌胃，1 次/ d，連續(xù)灌胃15 d，假手術(shù)組與模型組給予等體積的生理鹽水替代。

1.4.2 ICH模型的制備：選擇二次注入法制作ICH模型[6]，大鼠用10%水合氯醛麻醉(38 mg/kg)，俯臥位固定于立體定位儀上。固定大鼠頭部，調(diào)整高度使大鼠前后囟處于同一水平，以30號針頭通過顱骨鉆孔進入左側(cè)基底節(jié)區(qū)(前囟后0.6 mm，左旁開3 mm，深度5.8 mm)。分2次緩慢注射大鼠自體血60 L(間隔時間2 min)，注射完畢后停針5 min，分2次緩慢退針(間隔時間2 min)。假手術(shù)組以同樣的方法，注射60 μl生理鹽水。手術(shù)結(jié)束，骨蠟封閉針孔，消毒縫合頭皮，各組大鼠分籠飼養(yǎng)，正常飲食。

1.4.3 TUNEL技術(shù)檢測細胞凋亡：造模后48 h，斷頭取腦，切取進針孔前與進針后腦組織，用于制作腦組織石蠟切片。利用TUNEL法檢測細胞凋亡[7]，熒光顯微鏡下觀察分析結(jié)果(藍色熒光反應(yīng)細胞總數(shù)、綠色熒光反應(yīng)凋亡細胞數(shù))，隨機攝高倍鏡下6個視野,分析凋亡細胞陽性率。

1.4.4 腦組織中PAR-1蛋白表達的檢測：造模后48 h斷頭取腦，切取出血區(qū)腦組織100 mg，提取腦組織中全蛋白，所提取的全蛋白利用SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，加入兔抗鼠PAR-1抗體(1∶2 000 )4 ℃孵育過夜,抗GAPDH(1∶3 000)為內(nèi)參對照4 ℃孵育過夜；TBST清洗后加入山羊抗兔熒光二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，TBST清洗后應(yīng)用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜進行掃描，得到Western Blot條帶圖。利用Gelpro32圖像分析軟件獲取各個條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參進行比較分析，得出結(jié)論。

1.4.5 免疫組化檢測腦組織中PAR-1蛋白的表達：取前面制作的腦組織石蠟切片，進行免疫組化染色。用DAB顯色試劑盒檢測抗原抗體反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。隨機選取6個視野拍照，分別計算各組PAR-1陽性細胞比例，統(tǒng)計分析得出結(jié)論。

1.4.6 qRT-PCR檢測腦組織PAR-1 mRNA的表達：造模后48 h斷頭取腦，置于-80 ℃冰箱保存待測。利用Trizol提取大鼠腦組織總RNA，將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR技術(shù)分別測定各組大鼠腦組織PAR-1mRNA的表達。PCR所用引物由生物公司設(shè)計，PAR-1引物序列：Forward primer：5’-GAGACAG CCAGAA TCTGA GAGG-3’；Reverse primer：5’- TAAGTAGA CTGCCCT GCCCT -3’；片段長度166 bp；內(nèi)參對照GAPDH引物序列：Forward primer：5’-GACAT GCCGCCTG GAGAAAC-3’，Reverse primer：5’-AGCCCA GGATGCCCT TTAGT -3’，片段長度20 bp。PCR反應(yīng)體系25 μl：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×) 12.5 L；模板cDNA；大鼠PAR-1/GAPDH上下游引物；無核酸酶的水補充至25 L。置于預(yù)冷的伯樂八連管中，混勻離心后上機進行熱循環(huán)擴增。本研究以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法[8]進行相對定量分析，統(tǒng)計分析并制作箱式圖。

2 結(jié)果

2.1 LBP對ICH后神經(jīng)細胞凋亡的影響：假手術(shù)組于腦組織針道周圍可見TUNEL陽性細胞，散在分布且數(shù)量少，其余各組TUNE陽性細胞明顯增多。與假手術(shù)組比較模型組TUNEL陽性細胞率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，LBP組與尼莫地平組TUNEL陽性細胞率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠Tunel陽性細胞的比較(個，±s)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05。

2.2 LBP對ICH后腦組織中PAR-1蛋白表達的影響：模型組大鼠腦組織中PAR-1蛋白表達量較假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，各LBP給藥組PAR-1蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，表明LBP可以降低ICH后腦組織中PAR-1蛋白的表達，見圖1(目錄后)。

2.3 免疫組化檢測LBP對ICH后腦組織PAR-1表達的影響:PAR-1的表達主要分布于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞質(zhì)中，模型組的PAR-1陽性細胞率顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與模型組比較，LBP中劑量組、高劑量組PAR-1陽性細胞率顯著降低(P<0.05)，見圖2(目錄后)。

2.4 LBP對ICH后腦組織PAR-1 mRNA表達的影響：與假手術(shù)組比較，模型組PAR-1 mRNA的表達量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，LBP組PAR-1 mRNA的表達量顯著降低(P<0.05)，其中以LBP中劑量組下降最為明顯，而LBP各劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3(目錄后)。

2.5 ICH后腦組織神經(jīng)細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率的相關(guān)性分析：ICH后腦組織神經(jīng)細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率呈正相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)(r)為0.865(P<0.05)。

3 討論

ICH的病理生理機制復(fù)雜，ICH后繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷的重要因素，細胞凋亡在其中扮演著重要角色。目前，ICH缺乏循證醫(yī)學(xué)確切有效的治療手段，減輕出血后可出現(xiàn)繼發(fā)性腦損傷，因此尋找切實有效的神經(jīng)保護藥物一直是ICH研究領(lǐng)域的重要課題。LBP是枸杞中提取的主要活性成分，它抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到證實[4-5,9-10]，因此，猜想LBP也能抑制ICH引起的神經(jīng)細胞凋亡。

本研究選擇二次自體血注入法建立大鼠ICH模型，并在此基礎(chǔ)上，利用TUNEL實驗證實ICH能夠引起神經(jīng)細胞凋亡，且神經(jīng)細胞凋亡多發(fā)生在出血區(qū)及其周圍腦組織中，與其他學(xué)者實驗結(jié)果相符[11]。該實驗同時證實LBP能夠抑制ICH引起的神經(jīng)細胞凋亡，這種凋亡抑制作用在LBP中劑量組較為明顯。LBP通過抑制ICH引起的神經(jīng)細胞凋亡，進而保護ICH后腦組織。

ICH引起神經(jīng)細胞調(diào)亡的機制尚不清楚，有很多因素能夠誘發(fā)細胞凋亡，例如凝血酶、血紅蛋白的分解、炎細胞的浸潤等[12]。最新研究表明，PAR-1作為凝血酶受體家族中最主要的亞型，長期大量存在于ICH后血腫周圍組織中，它具有神經(jīng)細胞毒性作用[13-14]，參與凝血酶相關(guān)的諸多病理生理過程[15]，ICH后腦組織PAR-1表達的變化是凝血酶直接作用的結(jié)果[16]。因此，研究LBP對腦組織PAR-1表達的影響成了本實驗的又一重要內(nèi)容。

為了深入地了解LBP對ICH后神經(jīng)細胞中PAR-1表達的影響，使用Western Blot、免疫組化、qRT-PCR等實驗技術(shù)，從不同層面進行了探索，結(jié)果顯示ICH后出血區(qū)及其周圍腦組織中PAR-1蛋白的表達、PAR-1陽性細胞比例、PAR-1mRNA的表達顯著增加，LBP能夠在一定程度上抑制ICH引起的這種改變，表現(xiàn)為LBP各劑量組PAR-1蛋白的表達、PAR-1陽性細胞比例、PAR-1 mRNA的表達均較模型組顯著減少，尤以中劑量LBP的抑制作用最強。作為補充，我們利用SPSS軟件對腦組織神經(jīng)細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率進行了相關(guān)性分析，證實ICH后神經(jīng)細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率呈正相關(guān)性。

綜上所述，ICH后出血區(qū)及其周圍腦組織中可見神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生與PAR-1表達的上調(diào)，而LBP不僅能夠抑制大鼠ICH引起的神經(jīng)細胞凋亡，而且能夠抑制ICH后PAR-1的表達，進而對ICH后腦組織起到一定的保護作用，ICH后神經(jīng)細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率呈正相關(guān)性關(guān)系。因此，LBP能夠抑制ICH引起的神經(jīng)細胞凋亡，而這種抑制作用似乎與PAR-1有著某種內(nèi)在聯(lián)系，其具體機制需要通過進一步的實驗去探索。

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Effect of Lycium Barbarum Polysaccharides on the neuronal apoptosis and protease-activated receptor-1 expression after Intracerebral hemorrhage

ZOUYourui1,HUOGuojin2,WANGJuncheng3,WUQiao3,SHENBing1.

1.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan，750004,China;2.TheFirstHospitalofYulin,Yulin,719000,China;3.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,750004,China

SHEBin，Email:shenbing315@sina.com

Objective To observe the effect of Lycium Barbarum Polysaccharides (LBP) on the neuronal apoptosis and protease-activated receptor-1(PAR-1) expression after Intracerebral hemorrhage (ICH) in order to discuss its possible mechanism.Methods 72 SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，LBP low/moderate /high dose group，nimodipine group(n=12).Preoperatively 15th,LBP low /moderate /high group were given LBP 50,100,200 mgokg-1 by gavage，nimodipine group was given nimodipine 40 mg/kg by gavage，sham group and model group were given the same amount of saline,which were given for 15 days,1 time per day,.After gavage,using autologous blood to inject caudate nucleus in order to build rat ICH model.The neuronal apoptosis was assessed by TUNEL assay.The impact of LBP on the PAR-1 expression was detected by Western Blot,immunohistochemistry and RT-PCR techniques.Results Neuronal apoptosis rate,PAR-1 positive rate,PAR-1 protein and PAR-1mRNA expression in the ICH group were significantly higher than sham-operated group(P<0.05).Neuronal apoptosis rate,PAR-1 positive rate，PAR-1 protein and PAR-1 mRNA expression in the each dose group of LBP were significantly lower than the ICH group(P<0.05).Correlation analysis confirmed a positive correlation between neuronal apoptosis rate and PAR-1 positive rate after ICH.Conclusion LBP can not only reduce the neuronal apoptosis,but also inhibit the expression of PAR-1 after ICH.It has a protective role in cerebral after ICH.

Lyciumbarbarumpolysaccharides;Intracerebralhemorrhage;Apoptosis;Protease-activatedreceptor-1

10.13621/j.1001-5949.2017.06.0481

寧夏科技支撐計劃項目(2013ZY8160)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏 銀川 750004 2.陜西省榆林市第一人民醫(yī)院，陜西 榆林 719000 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004

鄒有瑞(1985-)，男，蒙古族，內(nèi)蒙古籍，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，從事神經(jīng)外科研究方向。

沈冰，Email:shenbing315@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170614.1314.002.html

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2016-12-14 [責(zé)任編輯]王凱榮