少棘蜈蚣候選毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1b的原核表達(dá)與純化

吳茜，吳慧，吳磊，孟爾

（國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院生物信息研究中心，湖南長(zhǎng)沙410073）

少棘蜈蚣候選毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1b的原核表達(dá)與純化

吳茜，吳慧，吳磊，孟爾*

（國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院生物信息研究中心，湖南長(zhǎng)沙410073）

κ-SLPTX-Ssm1b是從少棘蜈蚣的cDNA文庫(kù)中獲得的一類(lèi)功能未知的毒素，它與鉀通道抑制劑κ-SLPTX-Ssm1a高度同源，由50個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含有3對(duì)二硫鍵的多肽分子.利用pET-43-His-SUMO原核表達(dá)載體，通過(guò)E.coli SHuffleTM菌種自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)，隨后利用鎳柱和RP-HPLC純化，并通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定其分子量為5532.1870 Da，與理論值5532.3 Da相符.其產(chǎn)量為1 mg/L，為進(jìn)一步鑒定其電生理活性奠定了基礎(chǔ).

原核表達(dá)；少棘蜈蚣；蛋白純化；E.coli SHuffleTM

電壓門(mén)控鉀通道（voltage-gated K+channels，Kv）是細(xì)胞膜上鉀離子通道的重要組成部分，可分為許多種類(lèi)，功能不盡相同，對(duì)應(yīng)的病變也會(huì)導(dǎo)致多種多樣的疾病，例如神經(jīng)麻痹、糖尿病、腫瘤增殖等[2-3].因此，對(duì)Kv通道的研究能夠促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的相關(guān)藥物提供理論研究基礎(chǔ).蝎子、蜘蛛、蜈蚣等有毒動(dòng)物的毒素是電壓門(mén)控離子通道靶向藥物的重要來(lái)源.動(dòng)物毒素可作用于受體和通道，且作用的靈敏性極高、選擇性極高，具有極高的成藥率[4-6].有不少研究表明，動(dòng)物毒素可以作用于多種細(xì)胞膜的離子通道[7-8]，并且對(duì)細(xì)菌、真菌等微生物有非常強(qiáng)效的殺滅作用[9-10].這些毒素可以作為研究工具來(lái)研究人類(lèi)的生理機(jī)制.例如少棘蜈蚣毒液的毒素κ-SLPTX-Ssm4a、?？舅豐hK-192均可專一結(jié)合并抑制淋巴細(xì)胞中廣泛分布的Kv1.3通道，后者可用于治療自身免疫疾病，目前正在臨床試驗(yàn)階段[11-12].另一種少棘蜈蚣毒腺的毒素κ-SLPTX-Ssm1a在1 μm的低濃度下即可完全抑制大鼠背神經(jīng)節(jié)中的鉀通道電流[13]，也是一種潛在的神經(jīng)藥物.

κ-SLPTX-Ssm1b（以下簡(jiǎn)稱κ1b）是產(chǎn)自少棘蜈蚣（Scoropendra subspinipes mutilans）的毒素，是其cDNA文庫(kù)中未被研究的毒素多肽，存在三對(duì)二硫鍵.毒素κ-SLPTX-Ssm1a（以下簡(jiǎn)稱κ1a）與κ1b的序列高度同源，存在有相同位置的三對(duì)二硫鍵[13]，因此與κ1b可能存在有類(lèi)似的空間結(jié)構(gòu)和相似的生理活性.本文使用大腸桿菌SHuffleTM菌株作為受體菌，其優(yōu)勢(shì)在于可表達(dá)富含二硫鍵的多肽，有利于這類(lèi)多肽的正確折疊.文章中使用pET-43a（+）作為原核表達(dá)載體，在T7啟動(dòng)子后面有His標(biāo)簽，使得重組蛋白可以被鎳柱吸附，從而達(dá)到純化的作用.His標(biāo)簽后、在毒素序列前加入SUMO標(biāo)簽，不僅可以提高毒素的可溶性[14-15]，還可以通過(guò)SUMO激酶（ULP1）切除標(biāo)簽，進(jìn)一步通過(guò)反相高效液相色譜（RP-HPLC）純化得到完整的κ1b毒素，從而避免了該多肽富含二硫鍵可溶性較差，易形成包涵體的問(wèn)題[16].最終，4 mL培養(yǎng)基表達(dá)后分離純化得到4 mgκ1b毒素，產(chǎn)量為1 mg/L，得到的純化后毒素為后續(xù)電生理活性檢測(cè)及藥物研究打下了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

E.coli DH5α菌種和KODFXPCR酶體系購(gòu)于日本東洋紡，E.coli SHuffleTM菌株菌種購(gòu)于美國(guó)紐英倫生物技術(shù)公司，pET-43a（+）載體購(gòu)于Novagen公司，BDS HYPERSILC18柱、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和DpnI酶體系購(gòu)于賽默飛世爾科技公司.DNA純化回收試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒由天根生化科技（北京）有限公司提供.DNA序列和引物合成以及其余試劑均生工生物工程（上海）股份有限公司提供.ULP1激酶由實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 重組表達(dá)載體pET-43-His-SUMO-κ1b的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載κ1b序列（UniProt蛋白接收號(hào)：251420），根據(jù)E.coli strain K12密碼子偏好性，JCat軟件（http：//www.jcat.de/）優(yōu)化得到DNA序列為GCTAACGATAAACCAATCGGTAAATGTGGTGATGCTA AACGTAACAAACCATGTCTGGCTTGTTCTCACCGTTCT TCTATCGCTGATTTCTACTCTAAATGTTGTACCTACGA TGCTGTTTACAACGGTTGTCTGGATAAACTGCGTCAC，并送到公司進(jìn)行合成.根據(jù)RF-cloning（Restriction Free cloning）[17]引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)上下游引物分別為κ1b-F：GCTCACCGTGAACAGATCGGTGGTGCTAACGATAA ACCAATCGGT，κ1b-R：GATGGTACCGTCGACGTCCTG CAGTTAGTGACGCAGTTTATCCAGAC.在κ1b之后加入終止密碼子TAA.通過(guò)RF-cloning將κ1b的DNA序列插入到改造后的pET-43a（+）載體的SUMO標(biāo)簽序列之后.PCR產(chǎn)物通過(guò)純化回收試劑盒回收后用DnpI酶進(jìn)行消化，后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并測(cè)序.

1.3 κ1b的表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)SHuffleTM菌株，在LB平板（含100 μg/mL氨芐青霉素）37℃培養(yǎng)過(guò)夜.挑取單克隆接種于3 mLZYM-505培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素），置于37℃搖床以220 rpm轉(zhuǎn)速搖菌8 h，隨后以1：1000的比例吸取500 μL菌液接種于500 mL ZYM-5051培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素），在搖床中以30℃，220 rpm培養(yǎng)16 h.4000 rmp，15 min離心收集細(xì)菌后用1M磷酸緩沖液（PBS）重懸細(xì)菌（每500 mL菌液用100 mLPBS），均質(zhì)機(jī)破碎后離心收集上清.上清過(guò)Ni-NTA柱，以200 mM咪唑洗脫.洗脫液以10KD超濾管進(jìn)行超濾，隨后以ULP1激酶4℃過(guò)夜酶切.酶切后樣品以0.45 μm濾頭過(guò)濾，13 000 rpm離心5 min后，以H2O（0.1%TFA）/乙腈（0.1%TFA）為流動(dòng)相，用C18反相純化柱（4.6×250 mm，5 μm）進(jìn)行反相液相色譜，流速1 mL/min進(jìn)行梯度洗脫，收集紫外光215 nm吸收下單峰樣品，凍干.

1.4 κ1b的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定

反相高效液相色譜分離純化所收集的單峰樣品采用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行檢測(cè).去離子水溶解凍干后樣品，分別取1 μL樣品與1 μL基質(zhì)CCA（α-Cyano -4-hydroxycinnamic acid）的飽和液（由0.1%TFA-50%乙腈-49.9%去離子水配置）混合，再取0.5 μL混合液點(diǎn)樣于樣品盤(pán)，室溫干燥后檢測(cè)樣品的分子量.

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-43-His-SUMO-κ1b的構(gòu)建

通過(guò)SOE-PCR技術(shù)將目的片段κ1b成功插入到載體上，其緊接于SUMO標(biāo)簽的DNA序列之后，位于His標(biāo)簽的框架內(nèi).使用DnpI酶消化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌落PCR.引物為F：GTCTGGCTTGTTCTCACCGTT，R：CACCACCAC CACCACTAATGTTAATT.PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，有一條很亮的條帶大小約為400 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，證明該基因插入到表達(dá)載體上.挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果也與目的片段DNA序列一致，說(shuō)明表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖2 κ1b的誘導(dǎo)表達(dá)與純化SDS-PAGE圖

圖3 κ1b的RP-HPLC純化圖

2.2 κ1b的表達(dá)與Ni柱純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)SHuffleTM菌株進(jìn)行培養(yǎng)，分別收集ZYM-505培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h后菌液、ZYM-5051培養(yǎng)基16 h后菌液、菌體破碎離心后沉淀和上清液、過(guò)兩遍Ni柱后流穿液、PBS洗脫液（含50 mM咪唑）、PBS洗脫液（含200 mM咪唑）、10 kDa超濾管超濾后內(nèi)管液、ULP1激酶酶切液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可知，在28 kDa左右大小處，ZYM-5051誘導(dǎo)后比未誘導(dǎo)時(shí)多出一條明顯的條帶，與融合蛋白大小相符，說(shuō)明目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功.由泳道3和4可知，融合蛋白存在于上清液中，可溶性好.過(guò)Ni柱兩次后融合蛋白絕大多數(shù)已掛柱，50 mM咪唑洗脫下多數(shù)與Ni柱非親和結(jié)合的雜蛋白，融合蛋白在200 mM咪唑濃度下被洗脫.泳道9顯示，融合蛋白酶切成功，多出一條3~6 kDa大小的條帶，與目的蛋白κ1b大小5532.3 Da一致.

2.3 κ1b的RP-HPLC純化與MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定

酶切產(chǎn)物通過(guò)反相液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離純化.以50 min的溶液梯度線性洗脫，乙腈濃度由15%梯度變化至65%.收集215 nm紫外光波長(zhǎng)檢測(cè)下單峰進(jìn)行凍干后質(zhì)譜鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3.圖3a所示目的峰在18.5 min左右出現(xiàn)，此時(shí)乙腈濃度約為23%.凍干后樣品以水溶解，通過(guò)反相液相色譜進(jìn)行二次純化.圖3b顯示梯度洗脫下僅有一個(gè)單峰，圖3b顯示凍干后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，僅有一個(gè)條帶在6 kDa左右.圖4b所示的質(zhì)譜結(jié)果5 532.1870 Da與理論值5532.3 Da相符，說(shuō)明制備所得目的蛋白κ1b純度較高.其產(chǎn)量為1.0 mg/L.

圖4 κ1b的質(zhì)譜鑒定分析圖

3 結(jié)果與討論

電壓門(mén)控鉀通道廣泛分布于哺乳動(dòng)物多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上，在有機(jī)體中參與了許多重要的生理功能，如細(xì)胞膜興奮性，神經(jīng)去極化等.同時(shí)它的病變也會(huì)引發(fā)許多的疾病，包括難以治愈的腫瘤、糖尿病等熱點(diǎn)疾病.因此，鉀通道藥物的開(kāi)發(fā)顯得極其重要.研究發(fā)現(xiàn)，蜈蚣等有毒動(dòng)物毒腺是離子通道活性多肽的重要來(lái)源.并且動(dòng)物毒素成藥率高，已有多種離子通道靶向毒素多肽來(lái)源藥物上市或處于臨床試驗(yàn)階段，因此從蜈蚣毒腺中分離具有藥用價(jià)值的毒素多肽十分必要.

本文選取了與對(duì)鉀通道電流有抑制作用的毒素κ1a同源性高且未知活性的毒素κ1b，由于毒素κ1a對(duì)鉀離子通道的抑制作用，因此對(duì)該毒素的研究對(duì)于篩選獲得鉀通道活性多肽毒素顯得尤為重要.獲得大量κ1b毒素的方法有多種，如直接分離、化學(xué)合成，異源表達(dá)等.本文選用在利于富含二硫鍵多肽正確折疊的菌株E. coli SHuffleTM中表達(dá)，使得大量獲得該毒素成本較低且易大量生產(chǎn).避免了從蜈蚣毒腺直接分離毒素所得量少且過(guò)程繁瑣的缺陷以及使用化學(xué)合成使得復(fù)性困難而難以形成正確的有活性的結(jié)構(gòu)的缺陷.通過(guò)構(gòu)建His-SUMO-κ1b的表達(dá)載體在E.coli SHuffleTM菌株中來(lái)融合表達(dá)毒素κ1b.ULP1激酶可以識(shí)別并切割SUMO標(biāo)簽獲得初步純化的κ1b毒素多肽.經(jīng)過(guò)反相高效液相色譜純化獲得高純度的κ1b毒素多肽質(zhì)譜鑒定確定正確且純度達(dá)到后續(xù)生理活性試驗(yàn)的要求.本文的研究為后續(xù)的κ1b的電生理活性檢測(cè)試驗(yàn)起了重要的作用，也為將來(lái)更多的為將來(lái)富含二硫鍵毒素的原核表達(dá)奠定了基礎(chǔ).

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Prokaryotic Expression and Purification of κ-SLPTX-Ssm1b，a Candidate of Toxin from Centipede Scolopendra Subspinipes Mutilans

WU Xi，WU Hui，WU Lei，MENG Er*
（Research Center of Biological Information，National University of Defense Technology，Changsha，Hunan 410073）

The κ-SLPTX-Ssm1b is a class of unknown toxins obtained from the cDNA library of the the centipede Scolopendra subspinipes mutilans，which is highly homologous to the potassium channel inhibitor，κ-SLPTX-Ssm1a.It consists 50 amino acid residues and 3 disulfide bonds.The coding sequence was obtained by gene synthesis after codon optimization and was inserted to an expression vector pET-43-His-SUMO expressed with auto-induction method in the cytoplasm of E.coli strain SHuffleTM.And it was then purified by Ni-NTA column and RP-HPLC.The molecular weight was 5532.1870 Da by MALDI-TOF mass spectrometry，with consistent of the theoretical value，5532.3 Da.The yield of expression is 1 mg/L，which lays the foundation for the identification of its electrophysiological activity.

prokaryotic expression；scolopendra subspinipes mutilans；protein purification；E.coli SHuffleTM

Q812

A

1671－9743（2017）05－0062－05

2017-04-02

國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué)校預(yù)研“離子通道抑制因子的作用機(jī)制”（JC13-02-16）.

吳茜，1994年生，女，湖北天門(mén)人，碩士研究生，研究方向：生物效應(yīng)；

*通訊作者：孟爾，1983年生，湖南長(zhǎng)沙人，講師，博士，研究方向：生物效應(yīng).