應(yīng)用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌

邱萬臣，楊 靖，時東彥*，范士英(.河北省清河縣人民醫(yī)院檢驗科，河北 邢臺 054000；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

應(yīng)用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌

邱萬臣1，楊 靖2，時東彥2*，范士英2
(1.河北省清河縣人民醫(yī)院檢驗科，河北 邢臺 054000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000)

目的應(yīng)用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶。方法收集30株耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和10株耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌，應(yīng)用全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌株鑒定和藥物敏感試驗，應(yīng)用Carba NP方法檢測碳青霉烯酶。結(jié)果30株鮑曼不動桿菌中，Carba NP試驗結(jié)果陽性23株，陽性率為76.7%。10株銅綠假單胞菌中，Carba NP試驗結(jié)果陽性8株,陽性率為80.0%。結(jié)論Carba NP方法操作簡單，試劑成本低，易于在實驗室開展，可快速檢測耐碳青霉烯類抗生素細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。

鮑氏不動桿菌；銅綠假單胞菌；碳青霉烯酶

鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌屬于非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院內(nèi)重要的機會致病菌，尤其在免疫力低下的患者中，可以引起嚴(yán)重的甚至致死性的感染，如敗血癥、呼吸機相關(guān)肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎等。近年來碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌檢出率呈上升趨勢，尤其碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌的檢出率上升最為明顯。碳青霉烯類抗生素一直是作為治療革蘭陰性桿菌的最后防線，但如此高的耐藥率導(dǎo)致目前出現(xiàn)了無藥可選的局面，故盡快尋找產(chǎn)生這種耐藥的機制，成為當(dāng)前研究的熱點。本研究應(yīng)用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，旨在及早報告臨床，從而為臨床選擇合適抗生素、減少醫(yī)療消耗、減少耐藥株傳播提供有效服務(wù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選擇從河北省清河縣人民醫(yī)院和

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床標(biāo)本分離所得的耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌共計40株，全部菌株均采用全自動細(xì)菌鑒定藥物敏感鑒定儀進(jìn)行驗證。菌株采用無菌紙片-20 ℃低溫保存。選取肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705碳青霉烯酶陽性對照質(zhì)控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706碳青霉烯酶陰性對照質(zhì)控菌株，藥物敏感質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 藥物敏感試劑 藥物敏感試驗平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，亞胺培南和美洛培南紙片(北京天壇試劑公司)，亞安培南西司他丁(默沙東制藥公司)

1.3 藥物敏感試驗方法 統(tǒng)一采用美洛培南和亞安培南紙片法檢測耐碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，依據(jù)美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2015年判斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，見表1。

表1 美洛培南和亞安培南對鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4 Carba NP檢測液的配制[2]A液：準(zhǔn)備25～50 mL容器，加入2 mL 0.5%酚紅溶液于16.6 mL蒸餾水中，然后加入180 μL 10 mmol/L ZnSO4溶液。用0.1 N NaOH或者10%HCl調(diào)節(jié)pH值為7.8±0.1。4～8 ℃保存1個星期，避免長時間光照。B液：檢測液A中加入12 g/L亞胺培南西司他丁鈉。計算B液需要量，平均1株菌需要100 μL B液。共配制15 mL A液，加入180 mg亞胺培南西司他丁備用。加完后不用再調(diào)pH值。4～8 ℃保存3 d，一般現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 Carba NP方法 分別設(shè)置A、B兩管。每管中加入100 μL 5 mol/L NaCl。用10 μL接種環(huán)挑取滿環(huán)經(jīng)過過夜培養(yǎng)的菌落加入到A、B兩管100 μL 5 mol/L NaCl溶液中，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705碳青霉烯酶陽性對照質(zhì)控菌株和肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706碳青霉烯酶陰性對照質(zhì)控菌株也分別加入到A、B兩管100μL 5 mol/L NaCl溶液中，蓋上蓋子，渦旋振蕩混勻。在標(biāo)記的A、B管中，分別對應(yīng)加入100μL A、B檢測液，蓋上蓋子，振蕩混勻。放入35 ℃溫箱中2 h后觀察結(jié)果。

1.6 結(jié)果解釋 依據(jù)美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2016年標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行結(jié)果解釋，見表2。

表2 Carba NP對于懷疑產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌試驗結(jié)果的解釋

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感試驗結(jié)果 統(tǒng)一采用美洛培南和亞安培南紙片法檢測耐碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，2種抗生素任意1種耐藥即可判定為碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，經(jīng)過篩選共收集耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌30株，耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌10株。

2.2 Carba NP檢測結(jié)果分析 30株鮑曼不動桿菌中Carba NP試驗結(jié)果陽性23株，陽性率為76.7%；10株銅綠假單胞菌中Carba NP試驗結(jié)果陽性8株，陽性率為80%(圖1)。

圖1 Carba NP 試驗結(jié)果

25，26，27：檢測菌株；1705：陽性對照；1706：陰性對照

3 討 論

近年來，由于廣譜抗生素的廣泛和不合理應(yīng)用，導(dǎo)致銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對多種抗生素出現(xiàn)了獲得性耐藥，并導(dǎo)致了多重耐藥甚至泛耐藥菌株。而碳青霉烯類藥物具有抗菌譜廣、抗菌活性強，同時能有效抑制幾乎所有革蘭陰性細(xì)菌生長的特性，成為臨床上治療多重耐藥菌感染的常用抗菌藥物。但隨著其臨床應(yīng)用的日益廣泛，耐碳青霉烯銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌逐漸增多，還有天然耐碳青霉烯類的細(xì)菌逐漸增多，如嗜麥芽窄食單胞菌，給臨床感染的預(yù)防與治療帶來了極大的困難。近幾年有關(guān)耐碳青霉烯類抗生細(xì)菌的報道越來越受到重視，無論從國家耐藥監(jiān)測網(wǎng)到省級耐藥監(jiān)測網(wǎng)還是醫(yī)院內(nèi)部都有此類菌的報道，耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌有逐年上升的趨勢，而耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌耐藥率變化不大。2012、2013年河北省細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)報道銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為35.0%和39.2%，而鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為70.9%和78.2%[4-5]。耐亞安培南的銅綠假單胞菌為33.0%，耐美洛培南的銅綠假單胞菌為33.4%[6-8]。2015年CHINET監(jiān)測網(wǎng)報道耐亞安培南的銅綠假單胞菌為27.6%，耐美洛培南的銅綠假單胞菌為23.4%，耐亞安培南的鮑曼不動桿菌為62.0%，耐美洛培南的鮑曼不動桿菌為70.5%[9-10]。

細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要耐藥機制有：①碳青霉烯酶產(chǎn)生;②外膜蛋白改變導(dǎo)致外膜通透性的減少;③外排泵的高度表達(dá);④青霉素結(jié)合蛋白靶位的改變，青霉素結(jié)合蛋白靶位改變主要見于革蘭陽性球菌，在革蘭陰性桿菌中較少見。碳青霉烯酶的產(chǎn)生一直被認(rèn)為是最常見的，碳青霉烯酶是一類能夠水解亞胺培南或者美羅培南等碳青霉烯類的一類β內(nèi)酰胺酶[11]。包括Ambler分類中的A、B、D三類酶。有重要臨床意義的是質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶基因型，主要包括亞胺培南銅綠假單胞菌酶(imipenemase, IMP)、亞胺培南酶(verona Imipenemase,VIM)、苯唑西林酶(oxacillinases,OXA)、產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia carbapenemase,KPC)和新德里一號金屬酶(New Delhi metalloid β-lactamase 1,NDM-1), D類碳青霉烯酶的水解作用是鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類的最主要原因,這類酶的基因位于質(zhì)粒和染色體上，OXA-23、OXA-24和OXA-58在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的較多[12]，IMP和VIM在銅綠假單胞菌中常見[13]。

Carba NP方法[14]是2015年美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦的碳青霉烯酶的生化檢測法。主要原理是測試菌水解亞胺培南的β內(nèi)酰胺環(huán)，通過pH指示劑的顏色變化(通常是用酚紅指示劑，顏色由紅色變?yōu)辄S色或橘黃色)判斷細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦這種試驗適用于腸桿菌和銅綠假單胞菌，而不動桿菌屬產(chǎn)生了大量弱的D類碳青霉烯酶，傳統(tǒng)的Carba NP很難檢測出在不動桿菌屬中高表達(dá)的OXA型的D類碳青霉烯酶。因此，建立一個改良的Carba NP(CarbAcineto NP)方法[15]用于檢測不動桿菌的碳青霉烯酶。在Carba NP試驗中，大量的蛋白抽提液會阻礙弱的碳青霉烯酶活性的釋放。而在CarbAcineto NP中，用高滲的5 mol/L NaCl取代了蛋白抽提液，可以使細(xì)菌完全溶解，釋放蛋白，并且挑取的菌量也增加了2倍，可以增加酶的釋放量，故可以更好地檢測鮑曼不動桿菌產(chǎn)酶情況。目前Carba NP試驗用于檢測腸桿菌科細(xì)菌的產(chǎn)酶情況研究較多，國外已經(jīng)有了報道[16]，但是國內(nèi)報道較少，對于鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的產(chǎn)酶檢測報道更少，因為收集菌株麻煩，且產(chǎn)酶量相對較低。因此，本研究選擇了臨床上耐藥率較高的2種細(xì)菌，篩選耐藥性較高的菌株進(jìn)行研究，以期能使得此方法盡快得到認(rèn)可和應(yīng)用。30株耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌中Carba NP試驗結(jié)果陽性23株。大量基因研究表明鮑曼不動桿菌產(chǎn)OXA-23類基因的碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌耐碳青霉類抗生素的主要耐藥機制[17]，故產(chǎn)碳青霉烯酶也是鮑曼不動桿菌最主要的耐藥機制，通過Carba NP方法檢測雖然不知道具體產(chǎn)酶的類型，但是可以檢測產(chǎn)酶的結(jié)果。Carba NP方法使用的試劑廉價，操作簡單，用時短，結(jié)果易于解釋，在普通實驗室就可以開展，可以為臨床及時應(yīng)用及調(diào)整抗生素提供快速有效的依據(jù)。

目前已經(jīng)公認(rèn)的碳青霉烯酶表型檢測方法為HODGE試驗，這個方法對檢測A類和D類碳青霉烯酶有很高的敏感度，包括檢測具有弱碳青霉烯酶活性的OXA23、GES-5，但是對于產(chǎn)金屬酶的敏感度較低。Girlich等[18]研究了對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌，檢測產(chǎn)NDM的敏感度只有50%。這可能是由于細(xì)菌釋放細(xì)菌素肽，干擾指示菌的生長，影響結(jié)果。由于金屬酶MBL的活性依賴Zn2+，研究者們往MH藥物敏感瓊脂中添加硫酸鋅(100 mg/L)，使敏感度提高到了85.7%。經(jīng)過長期實驗證明，由于不同種類碳青霉烯酶對藥物的水解作用有差異,另外如果菌株產(chǎn)CTX-M型ESBLs或高于亞胺培南和美羅培南AmpC酶并且伴有外膜蛋白表達(dá)減少或缺失可引起假陽性。由于此方法對于金屬酶檢測不到，對于過度表達(dá)的頭孢菌素酶可以導(dǎo)致假陽性，故此類方法目前在臨床中僅推薦用于腸桿菌科細(xì)菌的檢測，不能用于檢測鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，其他的表型檢測方法復(fù)雜，敏感度不高，故未被廣泛應(yīng)用。PCR是碳青霉烯酶基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可以精確鑒定碳青霉烯酶的種類。目前直接進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測的技術(shù)有普通PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、基因芯片等。PCR 缺點是成本較高，需要較高的專業(yè)技能，只能檢測已經(jīng)確定的基因。PCR方法[19]可以精確鑒定碳青霉烯酶的種類，但是實驗過程復(fù)雜，試劑消耗高，需要專門的儀器，并且只能鑒定已知的碳青霉烯酶基因，在普通實驗室很難開展。由于目前碳青霉烯類抗生素耐藥菌株分離率越來越高，故迫切需要一種簡便快速的方法應(yīng)用于臨床，2015年美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦了Carba NP方法。此方法雖然檢測的菌株和酶的種類增加了，但是操作仍然復(fù)雜，需要試劑種類繁多，操作需要專業(yè)人員。因此，仍需開發(fā)更適用、更簡便、更可靠的方法。

隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性逐漸增加，耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌明顯增加。這些耐藥菌株造成醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，給臨床治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，病死率高，無藥可用。耐碳青霉烯銅綠假單胞菌已成為全球關(guān)注的重大問題，應(yīng)加強對碳青霉烯類耐藥的細(xì)菌動態(tài)監(jiān)測，密切關(guān)注其耐藥的發(fā)生與發(fā)展，探討其耐藥機制，尋找快速檢測方法，從而有效延緩其耐藥性的進(jìn)展。

[1] Wayne PA. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing:Twenty-fifth Informational Supplement(M100-S25)[S]. CLSI：USA,2015.

[2] Diene SM,Rolain JM. Carbapenemase genes and genetic platforms in Gram-negative bacilli:Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter species[J]. Clin Microbiol Infect,2014，20(9):831-838.

[3] Wayne PA. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing:Twenty-sixth Informational Supplement(M100-S26)[S]. CLSI：USA,2016.

[4] 時東彥，趙建宏，李志榮，等.2013年河北省細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)三級甲等醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].臨床薈萃，2015，30(9)：965-969.

[5] 時東彥，趙建宏，李繼紅，等.2012年河北地區(qū)臨床分離細(xì)菌分布及耐藥性監(jiān)測[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，29(5):49-53，57.

[6] 董愛英,時東彥,曹麗軍，等.2013年河北省細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)三級甲等醫(yī)院臨床分離銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[J].臨床薈萃,2015，30(9):974-977.

[7] 魏宏蓮，王崇，蘇軍華，等.臨床分離銅綠假單胞菌耐藥性分析與監(jiān)控管理[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,36(1):45-47.

[8] 魏宏蓮,楊靖,袁茵,等.臨床分離銅綠假單胞菌分布及耐藥性監(jiān)測[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，31(2)：218-220.

[9] 張輝，張小江，徐英春，等.2005-2014年CHINET不動桿菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志，2016，16(4)：429-436.

[10] 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等. 2015年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志，2016，16(6)：685-694.

[11] 潘文森，張麗麗，于婧,等.多重耐藥鮑曼不動桿菌感染重癥肺炎患者預(yù)后相關(guān)因素分析[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，37(8)：869-873.

[12] van der Zwaluw K,de Haan A,Pluister GN,et al. The carbapenem inactivation method(CIM),a simple and low-cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in Gram-negative rods[J]. PLoS One,2015,10(3):e0123690.

[13] 張偉紅，葉慧芬，楊銀梅，等.耐亞胺培南鮑曼不動桿菌耐藥表型和碳青霉烯酶基因型分析[J].中國感染與化療雜志，2011，11(1)：45-48.

[14] Dortet L,Poirel L,Nordmann P. Rapid identification of carbapenemase types in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. by using a biochemical test[J]. Antimicrob Agents Chemother,2012,56(12):6437-6440.

[15] Dortet L,Poirel L,Errera C,et al. CarbAcineto NP test for rapid detection of carbapenemase-producing Acinetobacter spp[J]. J Clin Microbiol,2014,52(7):2359-2364.

[16] Tijet N,Patel SN,Melano RG. Detection of carbapenemase activity in Enterobacteriaceae:comparison of the carbapenem inactivation method versus the Carba NP test[J]. J Antimicrob Chemother,2015，70(1)：274-276.

[17] Nordmann P,Gniadkowski M,Giske CG,et al. Identification and screening of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. Clin Microbiol Infect,2012，18(5)：432-438.

[18] Girlich D,Poirel L,Nordmann P. Value of the modified Hodge test for detection of emerging carbapenemases in Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol,2012,50(2):477-479.

[19] Rumbo C,Gato E,López M,et al. Contribution of efflux pumps,porins,and β-lactamases to multidrug resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J]. Antimicrob Agents Chemother,2013,57(11):5247-5257.

(本文編輯：趙麗潔)

2016-12-27；

2017-02-19

邱萬臣(1981-)，男，河北清河人，河北省清河縣人民醫(yī)院主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事臨床檢驗學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：shidongyan73@126.com

R446.1

B

1007-3205(2017)07-0847-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.027