間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的影響

王 東，龐曉璐，王 梁，張立紅，王 燁(.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；.河北醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 05007；.河北省石家莊市中醫(yī)院肛腸科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的影響

王 東1，龐曉璐2，王 梁1，張立紅1，王 燁3
(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省石家莊市中醫(yī)院肛腸科，河北 石家莊 050000)

目的研究間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療緩解實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型疾病進程的機制，探討聯(lián)合治療對EAE小鼠炎癥的作用。方法正常健康C57BL/6雌性小鼠經(jīng)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)誘導(dǎo)構(gòu)建EAE小鼠模型，通過觀察EAE小鼠的臨床評分，判斷EAE小鼠使用間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇處理的效果。通過HE 染色和抗CD4的免疫組織化學(xué)檢測單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞對于脊髓組織的浸潤。應(yīng)用ELISA檢測白藜蘆醇和間充質(zhì)干細(xì)胞處理后EAE小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10的表達量。結(jié)果4組平均臨床評分、最大臨床評分、細(xì)胞浸潤、CD4+T細(xì)胞浸潤、IFN-γ、TNF-α mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于PBS處理組，mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于mBM-MSCs處理組和白藜蘆醇處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-4、IL-10 mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組高于PBS處理組，mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組高于mBM-MSCs處理組和白藜蘆醇處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療可以顯著延緩EAE疾病進程，同時聯(lián)合治療能夠顯著降低小鼠EAE模型的疾病嚴(yán)重性，從而改善EAE疾病的臨床評分；可以降低EAE小鼠脊髓中的炎癥細(xì)胞數(shù)目，并促進EAE小鼠Th1型向Th2型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)變。

腦脊髓炎，自身免疫性，實驗性；間質(zhì)干細(xì)胞；白藜蘆醇

多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性脫髓鞘疾病，呈現(xiàn)出多種神經(jīng)系統(tǒng)的病變。主要表現(xiàn)為脫髓鞘現(xiàn)象和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突缺失[1]。多發(fā)性硬化表現(xiàn)出緩解和進展2個疾病過程[2]。雖然導(dǎo)致多發(fā)性硬化發(fā)生的原因現(xiàn)在還不甚清楚，免疫系統(tǒng)破壞和產(chǎn)生髓鞘細(xì)胞的衰竭可能是其中潛在的機制。遺傳因素和環(huán)境因素如感染、環(huán)境污染也被認(rèn)為是其中潛在的誘因[3]。到目前為止，多發(fā)性硬化還沒有有效的治療方法?，F(xiàn)有的治療僅限于在疾病發(fā)生之后改善機體功能或是預(yù)防新的疾病發(fā)生。化學(xué)藥物治療是最有效的方法但存在不良反應(yīng)[4-5]。EAE模型是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性脫髓鞘疾病的模型，是一個腦部炎癥的動物模型，表現(xiàn)為 T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病特征[6]。這一模型由于能夠模擬多發(fā)性硬化等某些疾病的特征，所以被作為人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病包括多發(fā)性硬化等的動物模型而廣泛研究[7]。干細(xì)胞移植能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元的再生，是多發(fā)性硬化的一個潛在有效的治療方法。干細(xì)胞能夠分化成多種細(xì)胞群族并且能夠通過新的細(xì)胞重建修復(fù)損傷的組織，最終恢復(fù)失去的功能[8]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcells,NSCs)[9]2種類型的干細(xì)胞可以應(yīng)用于EAE的干細(xì)胞治療。MSC來源于成熟組織，能夠抑制介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞損傷和炎癥的T細(xì)胞，因此降低多發(fā)性硬化的癥狀。研究顯示MSC能夠調(diào)節(jié)EAE的免疫病理，也同樣能夠促進神經(jīng)細(xì)胞的保護作用[10]。NSCs是存在于大腦中多能干細(xì)胞的一個特殊的細(xì)胞類型。NSCs可以遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)里同時經(jīng)過神經(jīng)元分化，分化的細(xì)胞可以作為細(xì)胞代替治療的潛在來源[11]。實驗研究顯示神經(jīng)干細(xì)胞在EAE模型中是有治療效果的，在其他神經(jīng)退行性疾病中也可見治療效果。神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化成少突細(xì)胞并且降低脊髓和大腦中炎癥病灶的炎癥效應(yīng)，而且可以修復(fù)EAE小鼠中受損的髓鞘組織[12]。目前應(yīng)用2種干細(xì)胞治療多發(fā)生硬化均已經(jīng)進入到了臨床試驗階段。本研究旨在探討MSC聯(lián)合白藜蘆醇對EAE模型的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用C57BL/6 雌性近交系小鼠40只，18～20 g，6～8周。購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號:SCXK(京)2012-0001。動物飼養(yǎng)于室溫 (24±2) ℃的環(huán)境中，維持光-暗12 h循環(huán)交替，并給予足量的食料和潔凈飲水。從小鼠股骨和脛骨中分離骨髓細(xì)胞貼壁持續(xù)培養(yǎng)后經(jīng)流式抗體標(biāo)記，顯示Sca-1+、CD44+、CD45-、CD34-和 CD14-。確定培養(yǎng)細(xì)胞帶有MSC的表面標(biāo)記蛋白。

1.2 EAE小鼠模型的建立、分組及處理 將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成5 mg/mL，并按1∶1等體積加入完全弗氏佐劑 (其中結(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4 mg/mL)混合，乳化后按每只0.1 mL于小鼠脊柱兩側(cè)分四點皮下注射，第0 h及第48 h腹腔注射500 ng 0.5 mL百日咳毒素，建立EAE模型。免疫在乙醚麻醉和充分固定下進行。將EAE小鼠隨機分為4組(每組n=10)：sham-EAE對照組(PBS處理組)、mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組。mBM-MSCs在免疫后第7天采用尾靜脈注射(1.5×106個/ 200 mL PBS/每只小鼠)。白藜蘆醇治療則使用腹腔注射(30 mg/kg，在EAE免疫后每天1次連續(xù)注射7 d)。而對照小鼠尾靜脈注射等量PBS。用Knoz 5分評分法從免疫后的第5天開始對實驗小鼠評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分無癥狀；1分尾部失去張力；2分尾部無力伴隨后肢力弱；3分后肢癱瘓；4分后肢及前肢癱瘓，被動翻身后不能復(fù)原；5分瀕臨死亡或死亡。以±0.5分計算癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者?！懊咳辗e分均值”由當(dāng)日組內(nèi)所有動物神經(jīng)功能評分的分值總和除以該組動物數(shù)量所得。 4組小鼠年齡、體質(zhì)量均具有可比性。

1.3 觀察指標(biāo) 在免疫后第21天 取材。每組各取6只小鼠，經(jīng)水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，取腰膨大處脊髓石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片制成石蠟切片。采用HE法觀測炎癥浸潤情況，應(yīng)用CD4抗體檢測免疫細(xì)胞聚集情況。

1.4 檢測指標(biāo) 免疫后21 d將EAE小鼠處死，從心臟采血3 mL置于離心管中，靜置后3 000 r/min離心10 min，取上層血清。應(yīng)用小鼠ELISA試劑盒檢測血清中IFN-γ、TNF-α、 IL-4、IL-10水平。ELISA實驗操作按照試劑盒提供的操作規(guī)程。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗所測得數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，計量資料方差齊時采用F檢驗分析，方差不齊時采用非參數(shù)秩和檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組臨床評分比較 4組平均臨床評分與最大臨床評分mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于PBS處理組，mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于mBM-MSCs處理組和白藜蘆醇處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 4組炎癥細(xì)胞表達比較 4組細(xì)胞浸潤和CD4+T細(xì)胞浸潤mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于PBS處理組，mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于mBM-MSCs處理組和白藜蘆醇處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 4組炎癥因子水平比較 4組IFN-γ、TNF-α mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于PBS處理組，mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組低于mBM-MSCs處理組和白藜蘆醇處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4組IL-4、IL-10 mBM-MSCs處理組、白藜蘆醇處理組、mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組高于PBS處理組，mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組高于mBM-MSCs處理組和白藜蘆醇處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 實驗組臨床評分情況Table 1 Clinical score of the experimental group 分)

*P<0.05與PBS處理組比較 #P<0.01與mBM-MSCs處理組比較 △P<0.05與白藜蘆醇處理組比較(秩和檢驗)

組別細(xì)胞浸潤CD4+T細(xì)胞浸潤PBS處理組100100mBM-MSCs處理組68.50±7.70*57.80±6.80*白藜蘆醇處理組56.60±7.80*65.30±6.40*mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組26.40±4.10*#△22.50±3.60*#△F6.5796.146P0.0000.000

*P<0.05與PBS處理組比較 #P<0.01與mBM-MSCs處理組比較 △P< 0.05與白藜蘆醇處理組比較(q檢驗)

組別IFN-γTNF-αIL-4IL-10PBS處理組35.7±4.36.31±1.127.48±1.128.78±1.22mBM-MSCs處理組22.1±3.1*4.25±0.76*13.62±1.48*20.45±3.28*白藜蘆醇處理組20.4±2.8*4.03±0.64*14.35±1.55*23.47±3.11*mBM-MSCs聯(lián)合白藜蘆醇處理組13.4±1.8*#△2.42±0.47*#△19.17±2.21*#△37.58±4.79*#△F3.5884.6566.2294.132P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05與PBS處理組比較 #P<0.01與mBM-MSCs處理組比較 △P<0.05與白藜蘆醇處理組比較(q檢驗)

3 討 論

多發(fā)性硬化是最常見的影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病之一[13]。目前臨床急需改善多發(fā)性硬化的治療方法。將現(xiàn)有的治療方法聯(lián)合新的藥物針對疾病的不同階段進行治療是一個新的研究方向[14]。越來越多的實驗表明白藜蘆醇在多種免疫相關(guān)疾病如自身免疫性心肌炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰腺炎和視神經(jīng)炎等中發(fā)揮著潛在的治療效果[15]。骨髓來源的MSC具有免疫調(diào)節(jié)活性，能夠抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，并且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[16]。MSC能夠選擇性地遷移并靶向受損傷的組織，為保護神經(jīng)元和EAE小鼠的軸突損傷治療提供了一個特殊的方法。而白藜蘆醇和MSC聯(lián)合使用的治療效果在多發(fā)性硬化中的應(yīng)用還不多見。

根據(jù)既往報道和筆者前期的研究，MSC或是白藜蘆醇單獨使用能夠改善EAE小鼠的疾病嚴(yán)重情況；聯(lián)合使用MSC和白藜蘆醇更能保護小鼠的腦部完整性，延緩疾病進程[17-18]。筆者進一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療可以有效降低炎性細(xì)胞浸潤，并且增強免疫調(diào)節(jié)活性。而潛藏在這一效果中的機制有很多種可能。

聯(lián)合治療的免疫調(diào)節(jié)效果可能是由于改變了EAE小鼠炎癥因子IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Th1和Th2的相互平衡關(guān)系是決定EAE小鼠發(fā)病進程的一個關(guān)鍵因素。而細(xì)胞因子的平衡能夠決定自體免疫中的耐受性和敏感性。最近的研究表明，髓鞘特異性的T細(xì)胞介導(dǎo)了多發(fā)性硬化的發(fā)生，其中Th2與Th1的比例決定了炎癥的部位[19]。兩者的比例大于1會導(dǎo)致腦脊髓實質(zhì)中的炎癥[20]。在起始的免疫原性多肽的活化下，初始T細(xì)胞能夠分化成為2種輔助性T淋巴細(xì)胞，即Th1和Th2細(xì)胞[21]。Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，并且調(diào)控胞內(nèi)抗原的感染。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并且在根除蠕蟲和寄生蟲中發(fā)揮著必需的作用[22]。另外，還有其他的CD4+T細(xì)胞亞群存在并分泌高水平的IL-10和TGF-β，起著抑制Th1和Th2細(xì)胞反應(yīng)的作用。 EAE的敏感性與TNF-α和IFN-γ相關(guān)，這兩種都是Th1細(xì)胞的初始促炎癥細(xì)胞因子[23]。然而Th2細(xì)胞因子如IL-4和IL-10是抗炎細(xì)胞因子。TNF-α、IFN-γ、 IL-4、IL-10在EAE的病理過程中極其重要，是指導(dǎo)Th1和Th2細(xì)胞發(fā)育的標(biāo)志性細(xì)胞因子[24]。MSC能夠抑制T淋巴細(xì)胞活化和增殖，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化的免疫反應(yīng)，促進內(nèi)源性的修復(fù)，因此發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)的作用。而MSC和白藜蘆醇聯(lián)合使用改善了單獨治療的效果，表現(xiàn)出了協(xié)同的治療作用[25]。

另一個可能的機制就是抑制炎癥。炎癥是一個牽涉到免疫細(xì)胞、血管的保護性反應(yīng)，是組織遭受損傷刺激時的一個復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)。免疫炎癥消除了早期的細(xì)胞損傷成因，清除了壞死細(xì)胞和損傷組織并且起始組織修復(fù)，但是在復(fù)發(fā)緩解型EAE模型中炎癥能夠造成組織損傷。因此，抵抗炎癥成了治療最初始的一個目的[26]。多發(fā)性硬化及它的EAE動物模型是由活化的免疫細(xì)胞如T和B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，是中樞系統(tǒng)的免疫疾病[27]。淋巴細(xì)胞是被外周組織中的抗原激活，并且克隆擴增浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。它們產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子和氮氧化物，從而導(dǎo)致髓鞘脫失和軸突退化。影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗炎癥的藥物通過降低炎癥治療疼痛[28]，大半是止痛藥。非甾體抗炎藥能夠中和環(huán)氧合酶的活性減輕疼痛。環(huán)氧合酶能夠通過合成前列腺素促進炎癥的發(fā)生，而非甾體抗炎藥能夠防止合成前列腺素，從而減輕疼痛[29]。本研究結(jié)果顯示，MSC或是白藜蘆醇單獨使用，或是聯(lián)合使用都能顯著地降低T細(xì)胞的浸潤。最近的研究表明白藜蘆醇能夠與多種細(xì)胞中的分子相互作用，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白等[30]。通過這種方式，白藜蘆醇活化一系列轉(zhuǎn)錄因子，抑制抗凋亡基因，抑制多種蛋白激酶和血管生成相關(guān)基因的表達，并且下調(diào)炎癥生物分子的表達[31]。本研究與以往的關(guān)于白藜蘆醇抗炎活性的研究結(jié)果一致。

當(dāng)然，MSC聯(lián)合白藜蘆醇所起到增強效果的具體機制還有待于進一步深入探討。

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(本文編輯：劉斯靜)

Effects of mesenchymal stem cells combined with resveratrol on inflammation in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

WANG Dong1, PANG Xiao-lu2, WANG Liang1, ZHANG Li-hong1, WANG Ye3
(1.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUnivesity，Shijiazhuang050000，China；2.DepartmentofDiagnostics,HebeiMedicalUnivesity，Shijiazhuang050017，China； 3.DepartmentofProctology,theTraditionalChineseMedicineHospitalofShijiazhang，Shijiazhuang050000，China)

Objective To study in depth the machenism underlying the therapeutic efficiency of mesenchymal stem cell combined with resveratrol in encephalomyelitis(EAE), and to investigate the effect of mesenchymal stem cell combined with resveratrol on immune inflammation in EAE mice. Methods We investigate the therapeutic efficiency of bone marrow mesenchymal stem cell combined with resveratrol in experimental autoimmune encephalomyelitis by clinical score. The infliteration of immune cells such as monocytes and lymphocytes into brain was observed using HE staining and immunohistochemistry with anti-CD4 antibody. ELISA was conducted to detect the secretion of IFN-γ/TNF-α and IL-4/IL-10 inserum. Results The average clinical score, maximal clinical score, CD4+T cell infiltration, IFN-γ, TNF-α were lower in mBM-MSCs group, resveratrol group, mBM-MSCs combined resveratrol group than that in PBS group. The mBM-MSCs combined resveratrol treatment group was lower than the mBM-MSCs treatment group and the resveratrol treatment group(P<0.05); The levels of IL-4 and IL-10 were higher in mBM-MSCs group, resveratrol group, mBM-MSCs combined resveratrol group than that in PBS group. Combination treatment group was higher than mBM-MSCs group or resveratrol group. The differences were statistically significant(P<0.05). Conclusion Combination treatment with mBM-MSCs and resveratrol can significantly delay the progression of EAE disease. Combined treatment can reduce the number of infla- mmatory cells in EAE mouse spinal cord and promote the transition of type Th1 to type Th2 cytokines in EAE mice.

encephalomyelitis, autoimmune, experimental; mesenchymal stem cells; resveratrol

2017-02-15；

2017-05-25

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(20170534)

王東(1982-)，男，河北霸州人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事神經(jīng)內(nèi)科疾病診治研究。

R744.3

A

1007-3205(2017)07-0745-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.001