黃芪多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用

劉俊輝,李春江,李玉濤,2*(.河北省唐山市冀東眼科醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000;2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000)

·論 著·

黃芪多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用

劉俊輝1,李春江1,李玉濤1,2*
(1.河北省唐山市冀東眼科醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000;2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000)

目的觀察黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的治療作用并探討相關(guān)機(jī)制。方法將清潔級(jí)健康雄性SD大鼠45只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組和APS組各15只。使用鏈脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。造模后1周，APS組大鼠給予400 mg/kg APS灌胃，1次/d，連續(xù)治療8周。治療結(jié)束后，測(cè)量各組大鼠的血糖、體質(zhì)量，ELISA法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1 ICAM-1)的含量，免疫印跡方法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和p-Akt蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組和APS組血糖高于對(duì)照組，體質(zhì)量低于對(duì)照組(P<0.05)。模型組和APS組大鼠TNF-α、ICAM-1、VEGF和p-Akt表達(dá)明顯高于對(duì)照組，APS組TNF-α、ICAM-1、VEGF和p-Akt表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論APS可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、ICAM-1、VEGF和Akt的水平，通過抗炎、減少白細(xì)胞在糖尿病病變的視網(wǎng)膜黏附、影響Akt-VEGF信號(hào)通路起到對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；黃芪多糖；大鼠

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性、進(jìn)行性代謝疾病，發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)。糖尿病患者的糖、脂類、蛋白質(zhì)代謝混亂，引起多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼部的主要并發(fā)癥，為糖尿病患者常見的微血管病變之一[2]，隨著生活水平的提高和生活方式改變，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[3]，且出現(xiàn)眼部并發(fā)癥的病程逐漸縮短。病程>20年的糖尿病患者75%以上都伴隨著不同程度的DR。DR導(dǎo)致患者的視力急劇下降，并可能導(dǎo)致失明，給患者帶來極大痛苦，亦有患者出現(xiàn)抑郁[4]，不利于患者的治療，同時(shí)給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。有研究表明，早期DR表現(xiàn)為血管的神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡、血-視網(wǎng)膜屏障的破壞[5]。因此，早期進(jìn)行糖尿病患者的抗炎治療可能是預(yù)防DR的一種非常有效的方法。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用，但是APS對(duì)于DR抗炎作用的相關(guān)機(jī)制尚不十分清楚。本研究旨在探討APS對(duì)于糖尿病大鼠DR抗炎方面的作用及相關(guān)機(jī)制，從而為臨床治療DR提供重要的理論依據(jù)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量200～240 g，由天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(15只)、糖尿病模型組(15只)和APS組(15只)，所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。模型組和APS組大鼠接受鏈脲佐菌素左下腹腹腔注射建立糖尿病模型(鏈脲佐菌素溶于生理鹽水中，按60 mg/kg進(jìn)行注射)，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。鏈脲佐菌素注射72 h后尾靜脈測(cè)量血糖(血糖儀測(cè)定)，若血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病模型制作成功。造模后1周，APS組大鼠給予400 mg/kgAPS灌胃，1次/d，連續(xù)治療8周。對(duì)照組和糖尿病組大鼠每日給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 試劑 APS購(gòu)自上海士峰生物科技有限公司。鏈脲佐菌素購(gòu)自美國(guó)sigma公司。細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam公司。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、p-Akt、actin抗體及其他試劑均購(gòu)自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 APS治療結(jié)束后每只大鼠稱體質(zhì)量，尾靜脈取血，血糖儀測(cè)量空腹血糖。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行腹腔麻醉，去雙側(cè)眼球，顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 ELISA法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜TNF-α和ICAM-1含量 視網(wǎng)膜加入組織裂解液，超聲粉碎后離心，取上清液蛋白定量，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中TNF-α和ICAM-1的含量。

1.3.2 免疫印跡法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜VEGF和p-Akt表達(dá) 視網(wǎng)膜超聲粉碎離心，測(cè)量蛋白濃度，SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，BSA封閉后加入相應(yīng)抗體4 ℃過夜，漂洗后加入二抗孵育，顯影，采集圖像。目的蛋白和actin比值為相對(duì)蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖與體質(zhì)量情況 模型組和APS組血糖高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與APS組血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和APS組體質(zhì)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與APS組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別血糖(mmol/L)體質(zhì)量(g)對(duì)照組6.15±0.57389.56±20.08模型組22.37±4.31*247.53±18.36*APS組21.56±2.03*238.77±17.54*F83.940195.595P0.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較(LSD-t檢驗(yàn))

2.2 ELISA法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α和ICAM-1的表達(dá) 模型組和APS組大鼠TNF-α和ICAM-1表達(dá)明顯高于對(duì)照組， APS組TNF-α和ICAM-1表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

組別ICAM-1(μg/g)TNF-α(ng/L)對(duì)照組3.69±0.5713.52±2.61模型組7.67±0.48*19.73±4.48*APS組4.99±0.37*#15.62±2.25*#F133.67390.862P0.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較 #P<0.05與模型組比較(LSD-t檢驗(yàn))

2.3 免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF和p-Akt表達(dá) 模型組和APS組大鼠VEGF和p-Akt表達(dá)明顯高于對(duì)照組，APS組VEGF和p-Akt表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 免疫印跡法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜VEGF和p-Akt表達(dá)

Figure 1 Expression of VEGF and p-Akt detected by western blot

組別VEGFp-Akt對(duì)照組0.28±0.040.23±0.07模型組0.83±0.09*0.94±0.21*APS組0.49±0.08*#0.45±0.09*#F97.637126.255P0.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較 #P<0.05與模型組比較(LSD-t檢驗(yàn))

3 討 論

DR是糖尿病常見的一種微血管并發(fā)癥，同時(shí)也是全世界人群失明的一個(gè)主要原因[6]。DR對(duì)自尊心造成極大的影響并且給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。目前DR的主要治療方法是疾病早期行激光光凝術(shù)以及疾病晚期使用玻璃體手術(shù)，該方法對(duì)患者的視力造成損害并且會(huì)帶來不適的感覺。因此，對(duì)DR有效治療藥物的研究就顯得至關(guān)重要。

DR的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括了血管、炎癥、神經(jīng)等方面的機(jī)制[7]。近年來越來越多的研究證實(shí)DR是一種與炎癥密切相關(guān)的疾病，炎癥過程導(dǎo)致DR結(jié)構(gòu)和功能的改變[8]。炎癥過程促進(jìn)了DR的病理結(jié)構(gòu)改變，包括血-視網(wǎng)膜屏障的破壞、視網(wǎng)膜新生血管的形成、視網(wǎng)膜谷氨酸代謝障礙、視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡等[9]。糖尿病患者的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致了視網(wǎng)膜組織中白細(xì)胞的增多，從而引發(fā)了炎癥因子的過度表達(dá)。所以，控制DR的炎癥反應(yīng)是治療DR的重要策略之一。

APS是中藥黃芪三大藥效成分中含量最多且活性最強(qiáng)的一種多糖類物質(zhì)。大量研究表明，APS具有抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、預(yù)防衰老等作用[10]。陳紅霞等[11]將APS應(yīng)用于糖尿病大鼠，APS發(fā)揮抗氧化、抗炎等功效，從而達(dá)到保護(hù)心肌的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，APS對(duì)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，APS有效減少了MDA、ICAM-1的表達(dá)并提高了caspase-3的表達(dá)，通過抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡機(jī)制起到保護(hù)肝臟的作用[12]。同時(shí)也有APS改善認(rèn)知功能障礙的相關(guān)研究。費(fèi)洪新等[13]應(yīng)用APS治療AD模型小鼠，APS降低了AD模型小鼠血腦屏障破壞程度，改善了AD模型小鼠的認(rèn)知功能并保護(hù)了海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過抑制Aβ沉積、降低白細(xì)胞介素6蛋白水平(發(fā)揮抗炎作用)而在AD治療中發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，APS對(duì)腦外傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力也有作用，APS能夠提高SOD的活性，清除氧自由基，通過抗機(jī)體氧化應(yīng)激提高腦外傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[14]。

高血糖導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激，并且與細(xì)胞炎癥和炎性細(xì)胞因子的釋放密切相關(guān)[15]。炎性細(xì)胞因子在DR的新生血管形成過程中起到了重要作用，在DR的發(fā)展過程中，視網(wǎng)膜炎癥和白細(xì)胞黏附微血管(白細(xì)胞淤滯)促進(jìn)血-視網(wǎng)膜屏障的破壞[16]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞活化后產(chǎn)生的一種多功能的炎癥因子，與血視網(wǎng)膜屏障的破壞和血管細(xì)胞死亡呈正相關(guān)，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的觸發(fā)器[17]。ICAM-1在DR患者中升高，ICAM-1表達(dá)的增多促進(jìn)白細(xì)胞在糖尿病視網(wǎng)膜的黏附。白細(xì)胞黏附是糖尿病視網(wǎng)膜炎癥早期的變化之一，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的減少和血-視網(wǎng)膜屏障破壞[16]。若ICAM異常表達(dá)，可能引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，也能夠造成白細(xì)胞釋放更多細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)。由于TNF-α和ICAM-1在DR 病理生理方面的重要性，本研究探討了APS對(duì)于糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)TNF-α和ICAM-1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示APS能夠抑制DR大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α和ICAM-1的表達(dá)。因此，推斷抑制炎癥反應(yīng)可能是APS治療DR的分子機(jī)制之一。

慢性高血糖刺激VEGF的合成和分泌，VEGF由低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管滲漏和新血管形成主要的一種生長(zhǎng)因子[18]。VEGF是一種血管內(nèi)皮生成和血管滲透性因子，被認(rèn)為是導(dǎo)致DR以及其他視網(wǎng)膜疾病視網(wǎng)膜滲透性和血-視網(wǎng)膜屏障完整性的關(guān)鍵分子[19]。VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)過程是十分復(fù)雜的，HIF-1α是調(diào)節(jié)高血糖狀態(tài)下VEGF表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子[18]。此外，Akt的激活是HIF-1α表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子，故Akt-VEGF信號(hào)通路的啟動(dòng)可影響視網(wǎng)膜新生血管形成的發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF和p-Akt表達(dá)增多，APS治療后VEGF和p-Akt表達(dá)減少。因此，推斷APS通過抑制Akt的激活降低VEGF的表達(dá)，從而改善糖尿病視網(wǎng)膜的血管病變。

綜上所述，APS可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、ICAM-1的表達(dá)，通過抗炎、減少白細(xì)胞在糖尿病病變的視網(wǎng)膜黏附起到對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。同時(shí)APS也影響了Akt-VEGF信號(hào)通路，從而減少了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF和p-Akt兩者的表達(dá)，可能通過此機(jī)制影響視網(wǎng)膜新生血管的形成。APS具有抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、改善認(rèn)知功能等作用，今后將繼續(xù)深層次探討APS的藥理作用，尤其是在眼科疾病中的基礎(chǔ)和臨床研究，從而為糖尿病視網(wǎng)膜病變乃至其他眼部疾病的患者的治療提供理論依據(jù)。

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(本文編輯：趙麗潔)

The protective effects of Astragalus polysaccharide on diabetic rats with retinopathy

LIU Jun-hui1, LI Chun-jiang1, LI Yu-tao1,2*
(1.DepartmentofOphthalmology,JidongOphthalmologyHospital,TangshanCity，HebeiProvince，Tangshan063000,China; 2.DepartmentofOphthalmology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital，Tangshan063000,China)

Objective To study the therapeutic effects of Astragalus polysaccharide(APS) on diabetic rats with retinopathy, and to explore its mechanism. Methods Forty-five cleaning degree healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups, normal control group, diabetic model group and APS group(n=15/group). The diabetic rats were made by streptozotocin intraperitoneal injection. One week after modeling, rats in APS group was administrated orally with APS(400 mg/kg) once daily for consecutive 8 weeks. After treatment, the blood glucose and body weight of different groups were measured. The expression of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) and intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) in retina of different groups were detected by ELISA. The relative expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and p-Akt in retina of different groups were tested by western blot. Results The blood glucose of model group and APS group was higher than control group, body weight of model group and APS group was lower than control group(P<0.05). The expression of TNF-α, ICAM-1, VEGF and p-Akt in model group and APS group was higher than that of control group. The expression of TNF-α, ICAM-1, VEGF and p-Akt in APS group was lower than that of model group(P<0.05). Conclusion APS could decrease the expression of TNF-α, ICAM-1, VEGF and p-Akt in retina of diabetic rats. Its protective effect on the retina may be through anti-inflammatory effect, reducing Leukocyte adhere to diabetic retina and affecting Akt- VEGF signaling pathways.

diabetic retinopathy； astragalan； rats

2017-03-02；

2017-03-22

劉俊輝(1978-)，女，河北唐山人，河北省唐山市冀東眼科醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事眼科疾病診治研究。

R587.26

A

1007-3205(2017)07-0797-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.013

*通訊作者