應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默人惡性黑素瘤細(xì)胞株A375中PPO基因的實(shí)驗(yàn)研究

王正想，張國強(qiáng)，高順強(qiáng)，趙桂松，劉思源*(.河北省滄州市中心醫(yī)院皮膚科，河北 滄州 0600；.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 0500；.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 05005)

·論 著·

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默人惡性黑素瘤細(xì)胞株A375中PPO基因的實(shí)驗(yàn)研究

王正想1，張國強(qiáng)2，高順強(qiáng)2，趙桂松3，劉思源3*
(1.河北省滄州市中心醫(yī)院皮膚科，河北 滄州 061001；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 050051)

目的探討RNA干擾技術(shù)沉默PPO基因?qū)θ藧盒院谒亓黾?xì)胞株A375細(xì)胞生長的影響。方法用PPO腺病毒載體轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，采用RT-PCR方法檢測A375細(xì)胞PPO的表達(dá)變化，采用MTT比色分析法檢測對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色檢測A375細(xì)胞早期凋亡的變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組人黑色素瘤A375細(xì)胞PPO基因 mRNA校正值低于空載體組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染PPO基因后3組第7天時(shí)細(xì)胞增殖OD值高于第1、3、5天，第5天時(shí)細(xì)胞增殖OD值高于第1、3天，第3天時(shí)細(xì)胞增殖OD值高于第1天(P<0.05)；轉(zhuǎn)染PPO基因后第1、3、5、7天時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖OD值低于空載體組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染PPO基因后3組第7天凋亡率高于第1、3、5天，第5天凋亡率高于第1、3天，第3天凋亡率高于第1天(P<0.05)；第1、3、5、7天時(shí)實(shí)驗(yàn)組凋亡率高于空載體組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論沉默PPO基因能誘導(dǎo)A375細(xì)胞早期凋亡，從而抑制A375細(xì)胞生長增殖。

黑色素瘤；基因沉默；RNA干擾

惡性黑色素瘤是一類起源于神經(jīng)嵴的黑素細(xì)胞惡性腫瘤，發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的第3位(6.8%～20.0%)[1]，是皮膚科領(lǐng)域最常引起死亡的惡性腫瘤。惡性黑色素瘤惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早，目前的治療方法不理想[2]。PPO(proliferation and phosphorylation oncogene)基因是利用克隆篩選技術(shù)找到的一個(gè)新的癌基因[3]，該基因位于1p36區(qū)，編號(hào)為KIAA0090， DNA長度約36 000 bp，cDNA長度6 022 bp，共有25個(gè)外顯子，編碼993個(gè)氨基酸。RNA干擾技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的從基因水平治療腫瘤的新方法。RNA干擾是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默。RNA干擾技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的從基因水平治療腫瘤的新方法，為治療對(duì)化療耐藥的惡性黑色素瘤開辟了新的途徑。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默PPO基因，抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中PPO基因相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而在細(xì)胞水平抑制惡性黑色素瘤的生長增殖。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤細(xì)胞株A375由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，EB腺病毒載體由武漢晶賽生物公司合成，四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)染色劑、DMEM(高糖型)培養(yǎng)基、 RT-PCR酶混合物試劑盒由美國 Fermentas公司提供，Trizol Reagent由美國Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人黑色素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含濃度為100 U/mL青霉素、鏈霉素，pH 7.2～7.4)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法 4～6 h待細(xì)胞完全貼壁，小心吸出各孔培養(yǎng)液。設(shè)空白對(duì)照組(內(nèi)無細(xì)胞只加培養(yǎng)基)﹑陰性對(duì)照組(單細(xì)胞懸液不加任何藥物干預(yù))﹑空轉(zhuǎn)錄病毒組(加入空載體)和實(shí)驗(yàn)組(加入PPO腺病毒載體)，各組均加入不含牛血清的培養(yǎng)基100 μL，空轉(zhuǎn)錄病毒組加入HK 0.5 μL，實(shí)驗(yàn)組加入PPO 0.5 μL，感染時(shí)間為90 min，每15 min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液1次混勻。90 min后移除含病毒的無血清培養(yǎng)液，加入含血清的常規(guī)培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=5、10、20、50、100時(shí)轉(zhuǎn)染效率分別為50%、67%、69%、70%、70%。MOI=50時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最大且增大MOI值轉(zhuǎn)染效率不再變化，故以下轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選取MOI=50時(shí)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞的影響。

1.2.3 RT-PCR檢測PPO基因mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞48 h后，用RT-PCR方法檢測PPO基因mRNA表達(dá)，證明腺病毒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞并部分沉默PPO基因。

細(xì)胞RNA的定量測定: 吸取2 μL RNA樣品，經(jīng)焦碳酸二乙酯水稀釋，用紫外分光光度計(jì)分別測定260 nm和280 nm光密度值(OD260和OD280)；RNA濃度以O(shè)D260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1 000的計(jì)算值表示；以O(shè)D260和OD280的比值(OD260/OD280)表示RNA的純度，該比值為1.8～2.0說明RNA純度較高，若該比值<1.8說明有酚、異硫氰酸胍、蛋白或DNA等物質(zhì)污染。

RT-PCR引物設(shè)計(jì):引物由上海捷瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成和PAGE純化，用無菌去離子水稀釋，PPO正義引物為5′-GCTTTCGGAG-AAGTCTAGTTCAAAG-3′，反義引物為5′-TCTCCACGAGGTATAGGTTAATGGT-3′；β-actin作為參照基因，正義引物為5′-GTGACTTT-GTCACAGCCCAAGA-3′，反義引物為5′-AACCTCCATGCTGCTGCTTACA-3′。瓊脂糖凝膠電泳:分別取5 μL RT-PCR產(chǎn)物、Marker，在1.5%的瓊脂糖凝膠中，恒壓80 V電泳30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，進(jìn)行分析。

1.2.4 MTT比色法檢測沉默PPO基因后A375細(xì)胞的增殖影響情況 ①實(shí)驗(yàn)分組：以A375細(xì)胞為研究對(duì)象，分為對(duì)照組(加入PBS)，空載體組(加入Adrs-5)，實(shí)驗(yàn)組(加入等量PPO)。②取對(duì)數(shù)生長期的A375細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至1×104個(gè)細(xì)胞/200 μL，分別接種到5個(gè)不同的96孔板中，每組接種6個(gè)復(fù)孔細(xì)胞培養(yǎng)過夜，按上述轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后蓋好蓋子，周邊貼膠布，在其上標(biāo)明日期。放入37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后第1、3、5、7天相同時(shí)間點(diǎn)前4 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃﹑5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，避光條件下振蕩10～15 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長492 nm處測定各孔光吸收值，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后凋亡情況 ①常規(guī)于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好的瓶裝細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/瓶，將細(xì)胞懸液分到7個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、空載體組、陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組又隨機(jī)分為第1天組、第3天組、第5天組、第7天組，并做標(biāo)記，分組后按上述轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②培養(yǎng)1 d后，取第1天組培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化，置于倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，倒掉胰酶，再加入剛才收集的舊培養(yǎng)基終止消化。用吸管反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，以確保所有貼壁細(xì)胞都能被吹打下來，但吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，同時(shí)盡可能不出現(xiàn)泡沫，細(xì)胞脫壁后形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液吸入相應(yīng)離心管中，1 000 r/min離心5 min。離心完畢后去上清液,緩慢加入1 mL冷PBS溶液，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min離心5 min，再用PBS洗滌細(xì)胞2次。③用250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106個(gè)/mL。④取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ，于室溫下避光孵育15 min，加入10 μL PI溶液。⑤混勻后于室溫下避光孵育15 min。⑥在反應(yīng)管中加400 μL PBS，流式細(xì)胞儀分析。

1.2.6 結(jié)果分析 以細(xì)胞凋亡指數(shù)表示細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次取平均值，計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR方法檢測PPO基因mRNA的表達(dá)情況 經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后48 h，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空載體組均在80 bp處出現(xiàn)電泳條帶，實(shí)驗(yàn)組PPO基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組人黑色素瘤A375細(xì)胞PPO基因 mRNA校正值為0.14±0.06，低于空載體組的0.25±0.02和陰性對(duì)照組的0.23±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 mRNA表達(dá)

1.空載體組；2.陰性對(duì)照組；3.實(shí)驗(yàn)組；M.Mark

Figure 1 Expression of mRNA

2.2 轉(zhuǎn)染PPO基因后對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375增殖抑制的影響 轉(zhuǎn)染PPO基因后3組第7天時(shí)細(xì)胞增殖OD值高于第1、3、5天，第5天時(shí)細(xì)胞增殖OD值高于第1、3天，第3天時(shí)細(xì)胞增殖OD值高于第1天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染PPO基因后第1、3、5、7天時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖OD值低于空載體組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空載體組與陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 轉(zhuǎn)染PPO基因后對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375早期凋亡的影響 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PPO基因后3組第7天凋亡率高于第1、3、5天，第5天凋亡率高于第1、3天，第3天凋亡率高于第1天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第1、3、5、7天時(shí)實(shí)驗(yàn)組凋亡率高于空載體組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空載體組與陰性對(duì)照組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2。

組別 OD值第1天第3天第5天第7天FP實(shí)驗(yàn)組 0.61±0.061.63±0.68#2.12±0.27#△2.76±0.32#△☆76.9500.000陰性對(duì)照組1.27±0.21*2.12±0.16*#2.47±0.14*#△2.92±0.02*#△☆326.0870.000空載體組 1.34±0.17*2.15±0.19*#2.62±0.37*#△2.98±0.11*#△☆140.7360.000F 95.3077.73112.9145.065P 0.0000.0000.0000.011

*P<0.05與實(shí)驗(yàn)組比較 #P<0.05與第1天比較 △P<0.05與第3天比較 ☆P<0.05與第5天比較(q檢驗(yàn))

組別 凋亡率第1天第3天第5天第7天FP實(shí)驗(yàn)組 30.10±2.0232.70±1.95#60.50±1.60#△63.40±5.10#△☆516.2210.000陰性對(duì)照組7.25±0.73*9.75±0.61*#15.53±0.76*#△25.35±0.46*#△☆2289.0430.000空載體組 7.40±0.58*10.30±1.21*#16.65±0.72*#△23.89±2.30*#△☆422.7420.000F 1571.9661368.3548095.687716.635P 0.0000.0000.0000.000

*P<0.05與實(shí)驗(yàn)組比較 #P<0.05與第1天比較 △P<0.05與第3天比較 ☆P<0.05與第5天比較(q檢驗(yàn))

圖2 細(xì)胞凋亡情況

Figure 2 The apoptosis of cells

3 討 論

惡性黑色素瘤治療的關(guān)鍵是早期診斷、正確分期，一經(jīng)確診首選完整切除原發(fā)灶，對(duì)于早期非侵襲性的病變，手術(shù)徹底清除病變?yōu)樽罴阎委熯x擇。對(duì)于晚期患者，主要為化療及免疫治療等。對(duì)于Ⅳ期有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)治療不能明顯提高生存率，干擾素可應(yīng)用于惡性黑素瘤的輔助治療[4]，但結(jié)果證明低劑量干擾素對(duì)惡性黑色素瘤的5年總生存率和無病生存率未見明顯改善[5]。雖然大劑量干擾素能在一定程度上提高5年生存率,但大劑量干擾素對(duì)患者的不良反應(yīng)目前尚難以解決。

隨著人們對(duì)惡性黑色素瘤分子生物學(xué)異常的逐步認(rèn)識(shí)，分子靶向治療成為惡性黑色素瘤治療的熱點(diǎn)，一些分子靶向治療藥物也相繼進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。雖然單獨(dú)應(yīng)用分子靶向治療藥物效果仍然不是很理想，但分子靶向藥物和化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，彌補(bǔ)了化療藥物療效的不足，從一定程度上提高了治療效果，開辟了惡性黑色素瘤新的治療途徑，是該病治療的新的發(fā)展方向。

目前研究報(bào)道中與惡性黑色素瘤分子靶向治療有關(guān)的基因有Ras基因、Raf基因、c-Kit基因等[6-8]。PPO基因作為惡性黑色素瘤的一個(gè)關(guān)鍵基因，能使ERK2和MEK1/2磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞增殖。PPO基因在卵巢癌、子宮癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤等多種癌組織和細(xì)胞株中都有高表達(dá)，并與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MAPK通路是一個(gè)與多個(gè)癌基因密切相關(guān)的通路，PPO基因作為這一通路中的重要基因，通過磷酸化MEK1/2，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]。劉亞玲等[11]制備了PPO抗體，并用免疫印跡法檢測PPO基因在惡性黑色素瘤組織中表達(dá)，結(jié)果顯示PPO蛋白位于相對(duì)分子質(zhì)量110 000附近，膜上無其他蛋白印跡，蛋白印跡清晰，表明PPO抗體具有很強(qiáng)的特異性，可以作為檢測惡性腫瘤的一種特異性抗體。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PPO基因在A375細(xì)胞中存在高表達(dá)[12]，然而能否通過RNA干擾方法沉默PPO基因，抑制MAPK通路中PPO基因相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而在細(xì)胞水平抑制惡性黑色素瘤的生長增殖，有待進(jìn)一步研究。本研究以腺病毒作為載體，利用RNA干擾方法沉默PPO基因，觀察對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

RNA干擾技術(shù)是研究基因調(diào)控的一種新手段，RNA干擾可用于治療多種單基因疾病以及與蛋白表達(dá)有關(guān)的疾病[13]。通過RNA干擾 技術(shù)沉默特殊基因的表達(dá)，在抑制腫瘤細(xì)胞生長及腫瘤的轉(zhuǎn)移和增加化療藥物敏感性等方面取得了很大進(jìn)展，許多臨床前研究已經(jīng)取得了豐碩成果[14-15]。RNA干擾所采用的載體主要有多聚復(fù)合物、納米顆粒載體、病毒和細(xì)菌載體[16-17]等，病毒載體又可分為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等。本研究所采用的載體為腺病毒載體，通過腺病毒載體干擾PPO基因，抑制PPO基因的轉(zhuǎn)錄，從而沉默PPO基因，通過觀察細(xì)胞增殖與凋亡情況，探討該基因與細(xì)胞增殖、凋亡之間的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目多，增殖旺盛，貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形，可見偽足，胞漿均勻、飽滿，胞膜光滑完整有光澤，折光性良好，可與周圍細(xì)胞融合成片狀，形成單細(xì)胞層；空載體組細(xì)胞增殖良好，貼壁能力、大小及細(xì)胞形態(tài)與陰性對(duì)照組無明顯差別；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長緩慢，貼壁能力差，呈散在分布，出現(xiàn)少數(shù)圓形細(xì)胞，部分細(xì)胞皺縮甚至破裂，失去原有的折光性，隨著時(shí)間延長，懸浮細(xì)胞增多，貼壁細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組和空載體組減少，且隨時(shí)間延長差別越明顯。從大體形態(tài)學(xué)上可以證實(shí)，沉默PPO基因后可以抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的分裂增殖，促進(jìn)其凋亡。因此，PPO基因有望成為惡性黑素瘤治療的新靶點(diǎn)。

本研究為進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞水平是否真正的轉(zhuǎn)染成功，并使PPO基因沉默，通過RT-PCR方法，在分子生物學(xué)水平觀察PPO基因mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染處理48 h實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空載體組均在80 bp處出現(xiàn)電泳條帶，但實(shí)驗(yàn)組PPO基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。由于在腺病毒干擾PPO基因中，并不是該基因的轉(zhuǎn)錄過程完全阻斷，故在RT-PCR結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組仍然在80 bp處出現(xiàn)電泳條帶，而不是完全消失。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)分子生物學(xué)的深入研究，如果能達(dá)到對(duì)某個(gè)基因的完全沉默，就會(huì)對(duì)某種細(xì)胞的影響作用更加明顯，在應(yīng)用到臨床工作中的療效會(huì)更加理想，從而增加該種方法治療惡性腫瘤乃至其他基因病的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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(本文編輯：趙麗潔)

Experimental study on PPO gene silencing in human malignant melanoma cell line A375 by RNA interference

WANG Zheng-xiang1， ZHANG Guo-qiang2， GAO Shun-qiang2， ZHAO Gui-song3， LIU Si-yuan3*
(1.DepartmentofDermatology,CangzhouCenterHospital,HebeiProvince,Cangzhou061000,China; 2.DepartmentofDermatology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China; 3.DepartmentofBoneOncology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

Objective To investigate the effect of silencing PPO gene on the growth of human malignant melanoma cell line A375 by RNA interference. Methods A375 cells were transfected with PPO adenovirus vector, expression of PPO was detectded by RT-PCR in the A375 cell, MTT colorimetric analysis method was used to detect the effects on the proliferation of A375 cells, by flow cytometry and Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining, changes of early apoptosis were detected. Results The expression of PPO mRNA was decreased in the transfection group than in the non-transfection group and negative virus group(P<0.05). After transfected with PPO, the OD values of the three groups at 7 d were higher than that at 1 d, 3 d and 5 d, the OD values of cells at 5 d were higher than at 1 d and 3 d, the OD values of cells at 3 d were higher than at 1 d(P<0.05). The OD value of transfection group was higher than the non-transfection group and negative virus group(P<0.05). After transfected, the apoptosis rate of the three groups at 7 d was higher than that at 1 d, 3 d and 5 d, the apoptosis rate of cells at 5 d was higher than that at 1 d and 3 d, the apoptosis rate of cells at 3 d was higher than that at 1 d(P<0.05). The apoptosis rate of transfection group was higher than the non-transfection group and negative virus group(P<0.05).Conclusion PPO gene silence can inhibit the proliferation and induce early apoptosis in A375 cells.

melanoma； gene silencing； RNA interference

2016-10-09；

2017-03-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30440086)

王正想(1982-)，男，河北滄州人，河北省滄州市中心醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事皮膚疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：18533112831@163.com

R739.5

A

1007-3205(2017)07-0805-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.015