液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留的國標(biāo)方法優(yōu)化

□ 何艷花 珠海南醫(yī)大生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺有限公司

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留的國標(biāo)方法優(yōu)化

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針對國標(biāo)方法《GB/T 21312-2007 動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中的雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留檢測存在耗時長和過柱容易堵塞的問題，從檢測方法參數(shù)如稱樣重量、離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心時間等方面對上述國標(biāo)方法進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的檢測方法有效地解決了國標(biāo)方法檢測過程耗時長和提取的溶液過柱容易堵塞的問題。

雞肉；恩諾沙星；沙拉沙星；離心機(jī)轉(zhuǎn)速；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

恩諾沙星和沙拉沙星屬于喹諾酮類藥物，國家指定為動物專用藥，廣泛用于動物疾病的治療。人長期食用含有喹諾酮類藥物的動物源性食品，喹諾酮類抗生素會在人體內(nèi)殘留蓄積，容易誘導(dǎo)耐藥性的傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。因此，喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的關(guān)注，聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會、歐盟已制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留限量。加強(qiáng)動物源性食品中喹諾酮藥物的檢測對食品安全具有重要意義，獲得快速、準(zhǔn)確的檢測方法尤其重要。目前已有檢測食品中多種喹諾酮藥物殘留的國標(biāo)方法《GB/ T 21312-2007 動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。但是，按國標(biāo)方法檢測雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留，稱樣重量和某些條件（如離心機(jī)轉(zhuǎn)速、離心時間）并不是最優(yōu)條件，導(dǎo)致檢測過程耗時長、過柱容易堵塞等問題，從而使檢測成本過高。本文優(yōu)化這些問題方法，在確保準(zhǔn)確度的前提下獲得快速、成本較低的檢測方法[1]。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

檸檬酸（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、甲醇（色譜純，Sigma）、乙腈（色譜純，Sigma）、甲酸（色譜純，Sigma）、氫氧化鈉（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、一級水（符合GB/T6682-2008要求）、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DR）、沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DR）、HLB固相萃取柱（Waters）。

1.2 儀器

Waters Xevo-TQD超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、Thermo RC 6PLUS落地高速離心機(jī)、FA1004N精密電子天平、pH700pH計、料理機(jī)、旋渦振蕩器、聚丙烯離心管、氮吹儀、SPE真空提取裝置20位。

1.3 方法

1.3.1 提取及凈化

（1）提取。稱取均質(zhì)試樣1.0 g（精確到0.1 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入4 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine緩沖液，1 000 r/min旋渦混合1 min，超聲提取10 min，1 8000 r/min離心15 min（溫度低于5 ℃），提取3次，合并上清液。

（2）凈化。HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL），使用時用6 mL甲醇洗滌、6 mL水活化。將步驟（1）提取液以2～3 mL/min的速度過柱，棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，再用6 mL甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮氣吹干，用1 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，1 000 r/min旋渦混合1 min，用于上機(jī)測定。

（3）基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備。將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用初始流動相逐級稀釋成1、100、10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品1.0 g，加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成1、5、10、25、50、75、100 ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，按照（1）、（2）與試樣同時提取和凈化。

1.3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCò BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

流動相：A：純甲醇，B：0.2%甲酸水溶液。

流速：0.3 mL/min。

柱溫：40 ℃。

進(jìn)樣體積10 μL。

電離模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）。

質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

被測物的母離子與子離子參數(shù)表見表1。

表1 被測物的母離子與子離子參數(shù)表

表2 不同樣重對過柱和氮吹時間的影響表

表3 不同樣重對恩諾沙星加標(biāo)回收率的影響表

表4 不同樣重對沙拉沙星加標(biāo)回收率的影響表

2 結(jié)果和分析

2.1 稱樣重量的選擇

國標(biāo)方法稱樣重量為5.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為20 mL；優(yōu)化方法稱樣重量為1.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為4 mL（按樣重同等比例縮小使用）。

結(jié)果表明，國標(biāo)方法提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間長，而優(yōu)化方法提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間顯著縮短（表2）；優(yōu)化方法和國標(biāo)方法測得低、中、高3個濃度的加標(biāo)回收率（表3、表4）均符合《GB/T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，優(yōu)化方法測得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。

2.2 離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心時間的選擇

國標(biāo)方法10 000 r/min離心5 min；優(yōu)化方法18 000r/min離心15 min。

結(jié)果表明，國標(biāo)方法提取的溶液過HLB柱凈化的時間明顯偏長，而優(yōu)化方法提取的溶液過HLB柱凈化的時間明顯縮短（表5），優(yōu)化方法和國標(biāo)方法測得低、中、高三個濃度的加標(biāo)回收率（表6、表7）均符合《GB/ T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，優(yōu)化方法測得的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。

2.3 稱樣重量、離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心時間的確定

國標(biāo)方法稱樣重量為5.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為20 mL，10 000 r/min離心5 min；優(yōu)化方法稱樣重量為1.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為4 mL，18 000 r/min離心15 min。

國標(biāo)方法提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間長，而優(yōu)化方法提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間顯著縮短（表8）；優(yōu)化方法和國標(biāo)方法測得低、中、高三個濃度的加標(biāo)回收率（表9、表10）均符合《GB/ T27404-2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，優(yōu)化方法測得的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。

3 討論

優(yōu)化后的方法與國標(biāo)方法的區(qū)別是稱樣重量由5 g減少到1 g，離心機(jī)轉(zhuǎn)速由10 000 r/min提高到18 000 r/min，離心時間由5 min延長到15 min。優(yōu)化前，稱樣重量較多，導(dǎo)致提取的溶液體積較大，提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間過長；離心機(jī)轉(zhuǎn)速過低、離心時間過短，導(dǎo)致樣液離心不徹底，提取的溶液過HLB時柱容易堵塞，延長凈化的時間。而優(yōu)化后，提取的溶液體積小和離心徹底，過柱時不容易堵塞，縮短了提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間，同時減少了試劑和氮氣的用量，低、中、高3個濃度的加標(biāo)回收率均符合《GB/T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，在確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確度的前提下大大降低了檢測成本。

表5 不同轉(zhuǎn)速和離心時間對過柱時間的影響表

表6 不同轉(zhuǎn)速和離心時間對恩諾沙星加標(biāo)回收率的影響表

表7 不同轉(zhuǎn)速和離心時間對沙拉沙星加標(biāo)回收率的影響表

表8 不同樣重、轉(zhuǎn)速和離心時間對過柱和氮吹時間的影響表

表9 不同樣重、轉(zhuǎn)速和離心時間對恩諾沙星加標(biāo)回收率的影響表

表10 不同樣重、轉(zhuǎn)速和離心時間對沙拉沙星加標(biāo)回收率的影響表

4 結(jié)論

優(yōu)化后檢測方法的稱樣重量為1 g，試樣液18 000 r/min離心15 min，低、中、高3個濃度的加標(biāo)回收率均符合《GB/T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，優(yōu)化方法測得的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。優(yōu)化方法提取的溶液體積小，離心徹底，過HLB柱不容易堵塞，顯著縮短了提取的溶液過HLB柱凈化的時間和洗脫液用氮氣吹干的時間，同時減少了試劑和氮氣的用量。優(yōu)化后的檢測方法快速、節(jié)省了成本，并且保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 21312-2007 動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.