遠(yuǎn)志提取物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的干預(yù)效果*

彭 芳，崔淵博，宋文穎，張家薇，劉俊保，關(guān)方霞

1)鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450064 2)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450007 3)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科 鄭州 450003 4)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

遠(yuǎn)志提取物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的干預(yù)效果*

彭 芳1)，崔淵博2)，宋文穎1)，張家薇1)，劉俊保3)#，關(guān)方霞4)#

1)鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450064 2)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450007 3)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科 鄭州 450003 4)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

#通信作者:劉俊保，男，1966年3月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向:中西醫(yī)結(jié)合，E-mail:Liu-371@sohu.com; 關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)、神經(jīng)認(rèn)知及調(diào)控，E-mail:guanfangxia@126.com

遠(yuǎn)志提取物；阿爾茨海默病；學(xué)習(xí)記憶能力；小鼠

目的：探討遠(yuǎn)志提取物對阿爾茨海默病(AD)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法：將28只6月齡雄性AD模型小鼠隨機(jī)均分為4組，對照組和A、B、C組。A、B和C組小鼠連續(xù)3個(gè)月分別口服遠(yuǎn)志提取物50、100、200 mg/(kg·d)，對照組小鼠口服等量溶劑。3個(gè)月后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，采用ELISA法測定小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量及β分泌酶1(BACE1)、γ分泌酶活性，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測小鼠海馬組織中腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測小鼠海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、BDNF酪氨酸激酶受體B(TrkB)及磷酸化TrkB(p-TrkB)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及磷酸化CREB(p-CREB)的表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組相比，C組小鼠穿越平臺次數(shù)增加、逃避潛伏期縮短(P<0.05)；A、B、C組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量降低，NEP、IDE mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，BDNF、p-TrkB及p-CREB蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.05)，且C組小鼠上述指標(biāo)的變化更明顯(P<0.05)。而3組小鼠海馬組織中BACE1和γ分泌酶活性、MMP-9表達(dá)及TrkB、CREB蛋白表達(dá)水平無變化(P>0.05)。結(jié)論：遠(yuǎn)志提取物可有效改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)Aβ降解與調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號通路可能是其分子作用機(jī)制。

Effect of radix polygalae on learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化的疾病，以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶能力減退、語言功能障礙及人格改變等為主要臨床表現(xiàn)。腦部病理特征主要包括β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)沉積形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失、炎癥反應(yīng)等[1]。 AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及多條信號調(diào)節(jié)途徑，迄今仍無特效療法。采用具有毒副作用小、效果良好、多靶點(diǎn)作用的傳統(tǒng)中藥進(jìn)行AD干預(yù)治療的研究越來越廣泛，可能成為有效治療AD的臨床策略[2]。遠(yuǎn)志提取物源自益智健腦中藥遠(yuǎn)志，含有皂苷、寡糖脂類等多種活性成分，具有提高記憶、抗炎、抗衰老等神經(jīng)保護(hù)作用。目前研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志提取物可明顯提高AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力并改善腦部Aβ沉積，但其作用機(jī)制仍不明確。該研究采用遠(yuǎn)志提取物干預(yù)AD模型小鼠，從行為功能學(xué)、生化與分子生物學(xué)水平觀察干預(yù)效果并探討可能的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 遠(yuǎn)志購自山西亳州百川藥業(yè)有限公司。遠(yuǎn)志提取物由遠(yuǎn)志經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡、超聲破碎、殘?jiān)^濾、茄型瓶旋蒸得到的膏狀提取物。經(jīng)聚乙二醇加蒸餾水溶解獲得[6-7]。Aβ40、Aβ42、β分泌酶1(BACE1)與γ-分泌酶ELISA檢測試劑盒，勻漿器，T-PER試劑等均購自Thermo Fisher公司；Trizol，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；β-actin、腦啡肽酶(neprilysin, NEP)、胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、BDNF酪氨酸激酶受體B(TrkB)及磷酸化TrkB(p-TrkB)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)及磷酸化CREB(p-CREB)兔抗鼠一抗，羊抗兔二抗，PVDF膜，脫脂奶粉，發(fā)光試劑盒等均購自Sigma公司。

1.2 動(dòng)物來源及實(shí)驗(yàn)分組 清潔級C57BL/6 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所，合籠繁殖，飼養(yǎng)于全自動(dòng)獨(dú)立送風(fēng)籠具，選取6月齡、經(jīng)PCR分子鑒定為APP+的雄性仔鼠用于實(shí)驗(yàn)。將28只雄性APP+小鼠(體重24～30 g)隨機(jī)均分為4組，每組7只。A、B和C組小鼠口服200 μL(1次/d)遠(yuǎn)志提取物，劑量分別為50、100、200 mg/kg，持續(xù)3個(gè)月；對照組口服200 μL溶劑。

1.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測 3個(gè)月連續(xù)干預(yù)后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮水池直徑為120 cm，高度為40 cm，共4個(gè)象限，平臺直徑和高度分別為15 cm、28 cm。平臺首先放在第一象限，水面高度略沒過平臺(0.5～1.0) cm，水溫控制在(25±1) ℃。首先進(jìn)行6 d的空間適應(yīng)性練習(xí)，小鼠在每天固定時(shí)間段內(nèi)入水練習(xí)2次，每次60 s，然后開始正式實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段需保持周圍環(huán)境不變?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：以組為單位將小鼠依次從水迷宮4個(gè)不同象限放入水池，采集器自動(dòng)采集記錄每只小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及逃避潛伏期、穿過平臺次數(shù)。反向探索實(shí)驗(yàn)：將平臺位置對調(diào)位于第Ⅳ象限，將小鼠依次從4個(gè)不同象限放入水池，觀察并記錄上述指標(biāo)。

1.4 小鼠海馬組織中Aβ40、Aβ42含量及BACE1、γ-分泌酶活性檢測 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，立即分離海馬組織，在勻漿器中加入一定量的T-PER試劑(含有蛋白酶抑物)制備腦組織勻漿。勻漿經(jīng)4 ℃、16 000 r/min離心1 h，收集上清液并測總蛋白濃度,用于可溶性Aβ40、Aβ42含量及BACE1、γ-分泌酶活性測定。離心后剩余的不溶物用體積分?jǐn)?shù)70%甲酸溶液重懸，室溫16 000 r/min離心1 h，收集上清液測定總蛋白濃度，用于檢測不溶性Aβ40、Aβ42含量。ELISA操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 小鼠海馬組織中NEP、IDE與MMP-9 mRNA的檢測 采用Trizol法提取海馬組織總RNA，測定濃度和純度并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ABI 7500 Real Time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每管反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線和熔解曲線并記錄Ct值。目的mRNA相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.6 小鼠海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測 采用Western blot法。分離小鼠海馬組織，液氮研磨充分，加入RIPA與PMSF(兩者體積比100：1)冰上裂解，提取總蛋白，測定濃度。每個(gè)樣本取300 μg總蛋白，加入Loading Buffer，100 ℃水浴10 min使蛋白變性，變性后的蛋白于-20 ℃保存或直接上樣檢測。每個(gè)蛋白樣品依次經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉，加β-actin(內(nèi)參)、NEP、IDE、MMP-9、BDNF、TrkB、p-TrkB、CREB、p-CREB一抗及二抗雜交，加發(fā)光劑，由成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶并測灰度值。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較4組間相關(guān)指標(biāo)差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較 見表2。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，C組小鼠穿越平臺次數(shù)增加、逃避潛伏期縮短(P均<0.05)。

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05；△：與B組比較，P<0.05。

2.2 4組小鼠海馬組織中Aβ40、Aβ42含量比較 見表3。與對照組相比，A、B、C組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量均下降，且B組和C組不溶性Aβ40、Aβ42含量低于A組(P均<0.05)。

表3 4組小鼠海馬組織中Aβ含量 μg/g

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05。

2.3 4組小鼠海馬組織中BACE1與γ-分泌酶活性的比較 見表4。4組BACE1與γ-分泌酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 4組小鼠海馬組織中BACE1與γ-分泌酶活性 U/mg

2.4 4組小鼠海馬組織中NEP、IDE、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較 見圖2、表5。與對照組相比，A、B、C組小鼠海馬組織中NEP、IDE mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P均<0.05)，C組上調(diào)更明顯(P<0.05)；而4組MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Western blot檢測小鼠海馬組織中NEP、IDE及MMP-9 蛋白

表5 4組小鼠海馬組織中NEP、IDE和MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05；△：與B組比較，P<0.05。

2.5 4組小鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 見圖3、表6。與對照組相比，A、B、C組小鼠海馬組織中BDNF、p-TrkB和p-CREB蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P均<0.05)，其中C組上述3種蛋白表達(dá)水平上調(diào)最顯著(P均<0.05)；而4組間TrkB和CREB蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 小鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表6 4組小鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05；△：與B組比較，P<0.05。

3 討論

Aβ由APP經(jīng)β-分泌酶與γ-分泌酶切割形成，產(chǎn)生毒性強(qiáng)的Aβ40與Aβ42，可溶性Aβ40、Aβ42可直接削弱突觸功能，由可溶性Aβ40、Aβ42聚合形成的不溶性Aβ40、Aβ42則主要沉積在腦部海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)形成老年斑，損害神經(jīng)元，引起認(rèn)知功能障礙[8-10]。因此，減少Aβ40、Aβ42含量曾經(jīng)被認(rèn)為是治療AD的策略之一。但由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)病過程可能有多條通路介導(dǎo)，僅針對減少Aβ而設(shè)計(jì)開發(fā)的藥物如分泌酶抑制劑及抗Aβ的單克隆抗體等并不能有效地改善AD的臨床癥狀且具有一定的副作用[11-12]。

遠(yuǎn)志作為一種常見的益智類傳統(tǒng)中藥，其提取物含有遠(yuǎn)志皂苷等多種活性成分，具有安神益智、祛痰、消炎消腫等功效。近年來研究[2,5,13]發(fā)現(xiàn)，采用遠(yuǎn)志提取物干預(yù)可明顯提高AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及降低Aβ水平，提示遠(yuǎn)志提取物用于治療AD具有良好的應(yīng)用前景。但遠(yuǎn)志提取物有效改善AD學(xué)習(xí)記憶能力及減少Aβ水平的具體作用機(jī)制目前尚不明確，且其對AD的干預(yù)效果是否與用藥劑量有關(guān)目前尚無定論。因此，該研究采用不同劑量的遠(yuǎn)志提取物干預(yù)6月齡APP+小鼠持續(xù)3個(gè)月后，在從行為功能學(xué)水平和生化與分子生物學(xué)水平觀察干預(yù)效果并探討可能的作用機(jī)制。動(dòng)物模型在6月齡左右開始在腦部海馬區(qū)出現(xiàn)Aβ沉積，9月齡Aβ沉積明顯增多[14]。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，200 mg/kg遠(yuǎn)志提取物干預(yù)APP+小鼠3個(gè)月可有效提高其學(xué)習(xí)記憶能力,表現(xiàn)為逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加。各干預(yù)組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量均低于對照組，表明遠(yuǎn)志提取物可有效降低APP+小鼠海馬中的Aβ水平。為探究Aβ含量的降低是由于Aβ生成的減少還是其降解的增加，研究中進(jìn)一步檢測了Aβ 生成酶BACE1和γ-分泌酶的活性及與Aβ降解密切相關(guān)的3個(gè)基因NEP、IDE、MMP-9 mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，各干預(yù)組小鼠海馬組織中BACE1、γ-分泌酶活性及MMP-9表達(dá)水平無明顯變化，而NEP和IDE表達(dá)水平顯著提高。NEP和IDE均屬于鋅金屬肽酶，研究[15]發(fā)現(xiàn)，隨年齡的增加或給予AD小鼠NEP或IDE抑制劑，均可導(dǎo)致Aβ沉積。遠(yuǎn)志提取物可能通過升高NEP和IDE表達(dá)水平以促進(jìn)Aβ降解，進(jìn)而減少Aβ沉積。

海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，各干預(yù)組小鼠海馬組織中BDNF、p-TrkB與p-CREB蛋白的表達(dá)量增加，而TrkB與CREB蛋白表達(dá)水平無明顯變化。BDNF的上調(diào)與海馬神經(jīng)再生及突觸功能重塑關(guān)系密切，促進(jìn)BDNF的表達(dá)也是干預(yù)AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在策略之一。BDNF受體TrkB的活化，具有誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖和存活的作用，在神經(jīng)元受損后的海馬神經(jīng)再生中起至關(guān)重要的作用[16]。CREB是海馬神經(jīng)元中許多信號通路的匯聚點(diǎn)，p-CREB在海馬新生未成熟神經(jīng)元中表達(dá)豐富，BDNF/TrkB通路的激活可導(dǎo)致p-CREB蛋白的增加，后者在海馬神經(jīng)再生的關(guān)鍵步驟中起重要作用[17]。近期有研究[18-19]表明，Tau蛋白的活化及Aβ含量的增加會分別抑制BDNF的表達(dá)和BDNF在海馬神經(jīng)元中的膜泡運(yùn)輸。該研究結(jié)果提示，遠(yuǎn)志提取物可能通過激活BDNF/TrkB信號通路進(jìn)而促進(jìn)了小鼠海馬神經(jīng)的再生，從而提高了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，遠(yuǎn)志提取物可改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號通路及減少Aβ沉積實(shí)現(xiàn)的。但遠(yuǎn)志提取物促進(jìn)小鼠海馬中BDNF的表達(dá)是否誘導(dǎo)了海馬神經(jīng)再生和突觸重塑尚不可知，需進(jìn)一步研究。

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(2016-10-25收稿 責(zé)任編輯王 曼)

PENGFang1)，CUIYuanbo2),SONGWenying1)，ZHANGJiawei1)，LIUJunbao3),GUANFangxia4)

1)DepartmentofClinicalMedicine，ZhengzhouShuqingMedicalCollege，Zhengzhou450064 2)TranslationalMedicineCenter，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou450007

3)DepartmentofTraditionalChineseMedicine，thePeople′sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003 4)SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

radix polygalae;Alzheimer′s disease;learning and memory ability;mouse

Aim: To investigate the effects of radix polygalae on learning and memory ability of Alzheimer′s disease(AD) mice.Methods: A total of 28 6-month-old AD male mice were equally allocated into 4 groups(control group, group A, group B and group C). Mice in the above 4 groups took radix polygalae at the dose of 0(the same volume of solvent),50,100,200 mg/kg orally once a day for three months, respectively. Three months later, the learning and memory ability was detected by Morris water maze test; the contents of soluble and insoluble Aβ40and Aβ42, the activity of BACE1 and γ-secretase in the hippocampus were examined by ELISA; the mRNA expressions of NEP,IDE and MMP-9 were measured by quantitative real time PCR; the protein expressions of NEP, IDE, MMP-9, BDNF, TrkB, p-TrkB, CREB and p-CREB in the hippocampus were tested by Western blot. Results: Compared with the control group, the number of platforms crossing increased, and the escape latency was shortened in group C; the soluble and insoluble Aβ40and Aβ42contents in the hippocampus of group A,B,C decreased, the mRNA and protein expressions of NEP and IDE were significantly upregulated, and the expression of BDNF, p-TrkB and p-CREB proteins in the hippocampus increased(P<0.05); the changes of the indexes mentioned above of group C improved significantly than group A and B(P<0.05). While the activity of BACE1 and γ-secretase, and MMP-9, TrkB, CREB expressions in the hippocampus showed no significant differences among the 4 groups(P>0.05). Conclusion: Radix polygalae could improve the learning and memory ability of AD mice, and degradation of Aβ and regulating BDNF/TrkB signaling pathway might be the possible molecular mechanism.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.008

*河南省科技廳重大攻關(guān)項(xiàng)目 12210130200

R259