AMWFA法結(jié)合HELP法在中藥復(fù)雜體系中的應(yīng)用

張斌，李曉如

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AMWFA法結(jié)合HELP法在中藥復(fù)雜體系中的應(yīng)用

張斌1, 2，李曉如1

(1. 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410083；2. 長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境監(jiān)測(cè)系，湖南長(zhǎng)沙，410004)

采用交互移動(dòng)窗口因子分析法(AMWFA)對(duì)2個(gè)體系中的2組二維數(shù)據(jù)片段進(jìn)行比較分析，得到2組二維數(shù)據(jù)片段中的共有組分；采用直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)，利用二維矩陣數(shù)據(jù)包含的色譜/光譜信息和局部因子分析以分辨出各組分的純色譜曲線和光譜, 得到具有真實(shí)物理意義的唯一解。將AMWFA和HELP相結(jié)合，對(duì)中藥復(fù)雜體系藥對(duì)桂枝?荊芥進(jìn)行解析。研究結(jié)果表明：AMWFA和HELP相結(jié)合能鑒定出藥對(duì)與桂枝、荊芥的組分?jǐn)?shù)分別為50，53 和 49 個(gè)，各占揮發(fā)油總體積分?jǐn)?shù)的91.87%，86.25%和92.86%；藥對(duì)與桂枝共有26個(gè)組分，與荊芥共有22個(gè)組分，產(chǎn)生兩單味藥中沒(méi)有的6個(gè)新成分；采用AMWFA法結(jié)合HELP法能最大程度且準(zhǔn)確地完成中藥復(fù)雜未知體系的鑒定。

中藥；交互移動(dòng)窗口因子分析法(AMWFA)；直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)；氣相色譜?質(zhì)譜

中藥的化學(xué)成分非常復(fù)雜，單味藥一般都含有大量化合物，復(fù)方藥的成分則更復(fù)雜。隨著分離以及鑒定技術(shù)的發(fā)展，新型的色譜?光譜二維聯(lián)用儀器使用日益廣泛，如氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、高效液相色譜?二極管陣列聯(lián)用儀(HPLC-DAD)、毛細(xì)管電泳?二極管陣列聯(lián)用儀(CE-DAD)等可以產(chǎn)生同時(shí)包含色譜和光譜信息的二維數(shù)據(jù)，并將色譜的分離能力與光譜的定性鑒定能力相結(jié)合，使全面定性、定量分析檢測(cè)像中藥這樣的復(fù)雜成分成為可能。交互移動(dòng)窗口因子分析法(AMWFA)作為化學(xué)計(jì)量學(xué)的一種分析方 法[1?2]，對(duì)2個(gè)體系中的2組二維數(shù)據(jù)片段進(jìn)行比較分析，最后得到2組二維數(shù)據(jù)片段中的共有組分定性結(jié)果。直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)利用二維矩陣數(shù)據(jù)包含的色譜/光譜信息，采用局部因子分析以分辨出各組分的純色譜曲線和光譜，得到具有真實(shí)物理意義的唯一解[3?4]。藥對(duì)桂枝?荊芥為中藥復(fù)雜體系，是相須相使的解表藥對(duì)[5]。桂枝(，RC)解表和營(yíng)、通陽(yáng)散寒、溫化水氣、補(bǔ)益里氣、通瘀活血。荊芥(，HS)具有祛風(fēng)解表，宣毒透疹，理血止痙的作用。二藥相須合用，取其協(xié)同作用，可增強(qiáng)疏散風(fēng)寒、促使發(fā)汗之功效，臨床上常用于感冒風(fēng)寒、發(fā)熱惡寒、頭痛、身痛諸癥。本文分別提取桂枝、荊芥和藥對(duì)桂枝?荊芥的揮發(fā)油，利用GC?MS進(jìn)行分離檢測(cè)，采用交互移動(dòng)窗口因子法(alternative moving window factor analysis，AMWFA)對(duì)其共有組分進(jìn)行比較分析[6?11]，結(jié)合直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法 (heuristic evolving latent projections，HELP)對(duì)重疊峰進(jìn)行分辨[12?15]，應(yīng)用質(zhì)譜庫(kù)相似度匹配對(duì)各組分進(jìn)行定性，采用總體積積分法進(jìn)行定量分析，完成對(duì)中藥復(fù)雜未知體系的鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與藥材

儀器為日本島津QP2010型氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀。藥材為桂枝、荊芥，均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥研究院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院中藥研究所鑒定。

1.2 揮發(fā)油提取

取桂枝50 g、荊芥50 g和藥對(duì)(桂枝50 g、荊芥50 g)按《中國(guó)藥典》[16]中的揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油。

1.3 揮發(fā)油的測(cè)定條件

色譜條件：OV-1色譜柱(長(zhǎng)度×內(nèi)徑為30.00 m× 0.25 mm)。升溫程序如下：起始溫度為40 ℃，以2 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，維持20 min。載氣為He，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，界面溫度為280 ℃。

質(zhì)譜條件如下：EI源電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，倍增電壓為1.28 kV，質(zhì)荷比/掃描范圍為20~600，掃描速率為3.8 scans/s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析在Gateway T8100計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，程序用MATLAB 6.5編寫(xiě), NIST107質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 AMWFA法對(duì)藥對(duì)和單味藥揮發(fā)油共有組分的比較分析

交互移動(dòng)窗口因子分析法(AMWFA法)作為化學(xué)計(jì)量學(xué)的一種分析二維數(shù)據(jù)的方法，其實(shí)是多組分光譜相關(guān)色譜法(MSCC)的拓展[1?2]，目標(biāo)是對(duì)2個(gè)體系中的2組二維數(shù)據(jù)片段進(jìn)行比較分析，最后得到被研究的2組二維數(shù)據(jù)片段中的共有組分定性結(jié)果。該法的主要思路如下。

先在1個(gè)體系中確定1個(gè)目標(biāo)矩陣，再利用單點(diǎn)投影法在另一個(gè)體系中找到相關(guān)的基本矩陣，接著利用矩陣的信息對(duì)矩陣進(jìn)行正交投影，從中提取兩者中的共有光譜信息。正交投影矩陣建立如下：

(I?)

其中：為單位矩陣，X為的廣義逆。用對(duì)基本矩陣沿色譜方向的每一條光譜矢量進(jìn)行投影 運(yùn)算：

=Py；1，2，…，

和分別表示原始光譜和投影光譜。是中的色譜最大保留時(shí)間掃描點(diǎn)。投影矢量本質(zhì)上是的正交互余空間的殘差矢量?？紤]到噪聲等因素的影響，計(jì)算和的內(nèi)積γ，作為判別依據(jù)。

()T，0≤≤1

把所有內(nèi)積(1，2，…，γ，…，γ)并對(duì)保留時(shí)間或者色譜掃描點(diǎn)作圖，即得到光譜相關(guān)色譜(MSCC)圖。當(dāng)等于0時(shí)，與完全正交，完全只剩下隨機(jī)噪聲，原始光譜與目標(biāo)矩陣光譜高度相關(guān)，與中的化學(xué)組分完全一致。反過(guò)來(lái)將作為目標(biāo)矩陣，作為基本矩陣進(jìn)行對(duì)比分析，得到反投影多組分光譜相關(guān)色譜圖(IP?MSCC)。

圖1所示為桂枝、荊芥和藥對(duì)桂枝?荊芥揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分離檢測(cè)得到的總離子流圖。以桂枝(保留時(shí)間為10.3~10.8 min)的A峰簇和桂枝?荊芥(保留時(shí)間為10.5~11.1 min)的B峰簇(圖2)為例，對(duì)該法進(jìn)行闡述。

圖3所示為由AMWFA法獲得的多組分光譜相關(guān)色譜圖(MSCC)和反投影多組分光譜相關(guān)色譜圖(IP?MSCC)。由圖3可知：掃描點(diǎn)20~140區(qū)域內(nèi)曲線與橫坐標(biāo)幾乎平行，中間的凸起是由噪聲引起，說(shuō)明A和B峰簇互相包含于對(duì)方中，所含成分一致。為進(jìn)一步確定2個(gè)體系中的共有組分?jǐn)?shù)，采用AMWFA法進(jìn)行共有秩分析。圖4所示為共有秩分析結(jié)果，前2個(gè)擬合值幾乎為0，從第3個(gè)開(kāi)始明顯增大，說(shuō)明A和B 峰簇有2個(gè)共有組分。

(a) 桂枝；(b) 藥對(duì)桂枝?荊芥；(c) 荊芥

(a) A峰簇；(b) B峰簇

(a) MSCC；(b) IP-MSCC

按照AMWFA 法，在共有組分?jǐn)?shù)為1 的區(qū)域，可以從其特征向量中獲取對(duì)應(yīng)的純質(zhì)譜。以A的色譜峰簇為矩陣，B色譜峰簇為矩陣，以矩陣的5~140區(qū)域?yàn)榛仃?，用移?dòng)窗口技術(shù)對(duì)矩陣中的5~160區(qū)域進(jìn)行掃描(移動(dòng)窗口數(shù)為2)，建立共有組分秩圖(圖5(a))及質(zhì)譜自相關(guān)曲線(圖5(b))。在共有組分秩圖中，有2個(gè)共有組分?jǐn)?shù)為 1 的區(qū)域(圖中陰影部分)，其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜自相關(guān)曲線也出現(xiàn) 2個(gè)平臺(tái)(見(jiàn)圖5(b))，且相似度幾乎為1。可分別從這 2個(gè)平臺(tái)中任意1點(diǎn)提取出共有組分的純質(zhì)譜即組分 1和2的質(zhì)譜。鑒定出2個(gè)共有組分為benzaldehyde (C7H6O，相似度99.72%)和[1R]-2,6,6-trimethyl-Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene(C10H16，相似度98.81%)，其相應(yīng)的解析質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6和圖7。

圖4 共有秩分析結(jié)果圖

(a) 共有秩圖；(b) 質(zhì)譜自相關(guān)曲線

2.2 HELP法對(duì)重疊峰的解析

直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)是一種逐步的推導(dǎo)式方式，它利用二維矩陣數(shù)據(jù)包含的色譜/光譜信息，采用局部因子分析以分辨出各組分的純色譜曲線和光譜，得到具有真實(shí)物理意義的唯一解。該法還具有從背景扣除到滿(mǎn)秩分辨一整套分析程序，適合于對(duì)未知分析體系直接定性定量解析，其最大的優(yōu)點(diǎn)是能對(duì)重疊峰甚至包峰進(jìn)行分析，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行最大程度地解析。其原理見(jiàn)文獻(xiàn)[3?4]，分析步驟簡(jiǎn)要如下。

1) 將色譜二維數(shù)據(jù)矩陣沿色譜方向分解為一系列相對(duì)簡(jiǎn)單的子體系，檢測(cè)各個(gè)子體系存在的背景與噪聲，并扣除背景及噪聲。

2) 根據(jù)演進(jìn)特征投影圖和特征結(jié)構(gòu)跟蹤分析秩圖，了解各組分的依次流出信息，確定組分?jǐn)?shù)以及各組分的選擇性區(qū)域和零濃度區(qū)域。

3) 利用滿(mǎn)秩分辨對(duì)各組分的選擇性區(qū)域和零濃度區(qū)域進(jìn)行分辨，獲得各組分的純色譜和光譜。

4) 將解析所得的各組分的純色譜和光譜乘積線性相加并與實(shí)際結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證解析結(jié)果的可 靠性。

現(xiàn)在以藥對(duì)桂枝?荊芥(保留時(shí)間為41.9~42.2 min)的C峰簇為例，對(duì)該法進(jìn)行闡述。C峰簇的總離子流圖見(jiàn)圖8。

(a) Benzaldehyde (C7H6O) 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖；(b) 解析質(zhì)譜圖

(a) [1R]-2,6,6-trimethyl-Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene(C10H16)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖；(b) 解析質(zhì)譜圖

圖8 C峰簇的總離子流圖

觀察圖8，此峰似乎是個(gè)單峰，但在GC-MS上檢索相似度不高。圖9所示為峰簇C扣除背景噪音后的秩圖，按照HELP原理，有2條特征值曲線(見(jiàn)曲線a和b)明顯高于噪聲水平，說(shuō)明有2組分重疊。從圖9可見(jiàn)：區(qū)域1為組分1的純組分區(qū)(組分1流入)；區(qū)域1+2為組分1和組分2的混合區(qū)(組分2流入)；區(qū)域2為組分2的純組分區(qū)(組分1已流完)。

a，b—特征值曲線；1—組分1區(qū)域；2—組分2區(qū)域；1+2—組分1+2區(qū)域。

圖10所示為C峰簇解析后的色譜圖。由圖10可知：應(yīng)用HELP分析得出C峰簇是2組分體系，化學(xué)組分分別為3-Phenyl-2-propenyl acetate(C11H22O2,相似度為92.12%)和3-[2-methoxyphenyl]-2-Propenal (C10H10O2，相似度為98.63%)，其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖和解析質(zhì)譜圖見(jiàn)圖11和圖12。

按照同樣的方法，對(duì)桂枝、荊芥和藥對(duì)桂枝?荊芥中的色譜峰逐步進(jìn)行分辨，可得到組分的純質(zhì)譜，再用質(zhì)譜庫(kù)對(duì)分辨出的組分進(jìn)行質(zhì)譜定性檢索，得到組分定性結(jié)果。采用總體積積分法，可以得到各個(gè)組分的定量分析結(jié)果。

1—組分1；2—組分2。

(a) 3-Phenyl-2-propenyl acetate(C11H22O2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖；(b) 解析質(zhì)譜圖

(a) 3-[2-methoxyphenyl]-2-propenal(C10H10O2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖；(b) 解析質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

1) 采用AMWFA法和HELP法對(duì)藥對(duì)桂枝?荊芥進(jìn)行解析，從藥對(duì)、桂枝和荊芥中分別鑒定出50，53 和 49 個(gè)組分，分別占揮發(fā)油總體積分?jǐn)?shù)的91.87%，86.25%和92.86%。藥對(duì)與桂枝共有26個(gè)組分，與荊芥共有22個(gè)組分，產(chǎn)生了2單味藥中沒(méi)有的6個(gè)新成分(體積分?jǐn)?shù)為1.02%)。從化學(xué)成分?jǐn)?shù)量及含量看，該藥對(duì)為2單味藥綜合作用的結(jié)果。

2) 中藥為復(fù)雜未知體系，使用一般的方法難以準(zhǔn)確定性。借助AMWFA法和HELP法進(jìn)行解析，能快速地獲取兩者間的共有組分，對(duì)重疊峰分辨后再進(jìn)行質(zhì)譜庫(kù)匹配，最大程度且準(zhǔn)確地完成了化學(xué)成分的定性定量，為中藥的快速發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支持。

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(編輯 陳燦華)

Application of alternative moving window factor analysis (AMWFA) and heuristic evolving latent projections(HELP) incomplicated system of Chinese medicine

ZHANG Bin1, 2, LI Xiaoru1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;2. School of Environmental Monitoring, Changsha Environmental Protection College, Changsha 410004, China)

Analysis of volatile components in herbal pair-(RC-HS), single herb RC and HS was performed with two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) data coupled with alternative moving window factor analysis (AMWFA) and heuristic evolving latent projections (HELP). The results show that by means of these methods of two-dimensional data,50,53 and 49 volatile chemical components in essential oil of HP RC-HS, RC and HS were determined qualitatively and quantitatively, accounting for 91.87%, 86.25% and 92.86% total volume fraction of essential oil of HP RC-HS, RC and HS, respectively. There are 26 common active constituents between HP RC-HS and single herb RC, and 22 common active constituents between HP RC-HS and single herb HS. The number of volatile chemical components in RC-HS is the result of synthesis effect from the two single herbs. Analysis of the complicated system of Chinese medicine can be performed with alternative moving window factor analysis and heuristic evolving latent projections.

Chinese herb; alternative moving window factor analysis(AMWFA); heuristic evolving latent projections (HELP); gas chromatography-mass spectrometry

10.11817/j.issn.1672?7207.2017.06.003

O629.9

A

1672?7207(2017)06?1425?07

2016?08?10；

2016?10?08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20175036，20235020)(Projects(20175036, 20235020) supported by the National Natural Science Foundation of China)

李曉如，教授，從事天然藥物化學(xué)研究；E-mail：xrli@csu.edu.cn