響應面法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝

趙立娜，陳紫紅，陳 濠，花朋朋，劉 斌,,*

（1.國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

響應面法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝

趙立娜1，陳紫紅2，陳 濠2，花朋朋2，劉 斌1,2,*

（1.國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

采用響應面分析法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝，以螯合物中硒含量為指標，考察亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比、反應溫度、反應時間和pH值對螯合反應的影響，同時建立螯合物制備工藝的二次項數(shù)學模型并驗證其可靠性，并利用紅外光譜法對菌草靈芝多肽-硒螯合物進行表征。結果表明：影響菌草靈芝多肽與硒離子螯合的因素主次順序為pH值＞反應溫度＞體積比＞反應時間，最佳的螯合工藝條件為反應時間60 min、反應溫度75 ℃、pH 9、亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比1∶2，最佳制備工藝條件下，螯合物中硒含量為（2 985.89±10.59）μg/g。采用紅外光譜法對螯合物進行表征，表明所得物質(zhì)為菌草靈芝多肽與硒的螯合物。本研究為合成有機硒化合物提供了一種新的原料，也為菌草靈芝的開發(fā)利用提供了一個新的思路。

菌草靈芝多肽；螯合物；響應面法；菌草靈芝多肽-硒螯合物

靈芝屬（Ganoderma）真菌隸屬于多孔菌科（Polyporaceae）藥食兼用菌，全世界共有108 種[1-2]。菌草靈芝是用菌草代替木屑栽培出來的，其藥用價值比單純用木屑栽培出的靈芝要高得多，其多肽所含的必需氨基酸豐富，營養(yǎng)價值高，易于被人體吸收，同時菌草靈芝多肽具有降血脂、降血壓、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等功效[3-5]。硒是維持生物體機能包括生長、發(fā)育、繁衍等不可或缺的一類物質(zhì)，雖然人體對硒的需求量極少，但是對生物體的生理健康和有關生理疾病的預防都與之密不可分。人體缺硒能造成體內(nèi)重要器官的功能失調(diào)，還會使得糖尿病、腫瘤、心血管疾病、白內(nèi)障、克山病等疾病的發(fā)病率提高[6-8]。由于人工合成的有機硒化合物的生物安全性明顯高于人工合成或天然的無機硒化物，甚至有些功能活性優(yōu)于無機硒[9]。因此，具有較高生物活性和較低毒副作用的有機硒化合物具有更廣闊的發(fā)展空間。

目前國內(nèi)外關于各種肽源與Fe、Zn、Ca等礦物質(zhì)離子螯合制備礦物質(zhì)螯合物的研究較多[10-12]，而以菌草靈芝為原料制備多肽-硒螯合物的研究鮮有報道。本研究利用菌草靈芝蛋白水解后的菌草靈芝多肽與硒螯合，優(yōu)化菌草靈芝多肽硒螯合物的工藝條件，制備菌草靈芝多肽-硒螯合物，可充分發(fā)揮多肽和礦質(zhì)元素對人體的雙重營養(yǎng)功能特性，為菌草靈芝開發(fā)和應用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌草靈芝 江西井岡山井祥菌草生態(tài)科技股份有限公司。

復合蛋白酶NS37119 諾維信（中國）生物技術有限公司；亞硒酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉等所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1600型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；KDC-40低速離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；J-25I型高速離心機 美國Beckman公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FE20型精密pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-3冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌草靈芝多肽的制備

菌草靈芝→粉碎→蒸餾水溶解（料液比1∶50）→調(diào)pH 11.0→60 ℃水浴1.5 h→6 層紗布過濾→取上清液→抽濾→調(diào)pH 2.5→4 500 r/min離心→ 沉淀冷凍干燥→靈芝蛋白→配成底物質(zhì)量分數(shù)3%→調(diào)pH 10.0→復合蛋白酶酶解（溫度50 ℃、酶/底物6 000 U/g）→50 ℃水浴1 h→沸水浴10 min滅酶→4 500 r/min離心10 min→上清液（菌草靈芝多肽溶液）

1.3.2 菌草靈芝肽-硒螯合物的制備

取一定量靈芝多肽溶液（取3 次平行），加入一定體積比例的0.5 mol/L的亞硒酸鈉溶液，充分攪拌，待pH值調(diào)節(jié)到一定值后，將其放置于一定溫度的水浴搖床中充分反應一段時間，反應后置于室溫冷卻，在4 500 r/min、10 min的條件下離心取上清液，加入5 倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，4500 r/min、10 min離心取沉淀，用無水乙醇對沉淀物洗滌數(shù)次，將其置于烘箱中進行低溫干燥處理使無水乙醇揮發(fā)，后進行凍干獲得多肽-硒螯合物粉末。

1.3.3 螯合條件單因素試驗

1.3.3.1 體積比（亞硒酸鈉溶液-多肽溶液）對螯合物中的硒含量的影響

體積比分別為1∶6、1∶3、1∶2、2∶3、5∶6，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，反應溫度80 ℃，pH 8.0，反應時間120 min。

1.3.3.2 反應溫度對螯合物中硒含量的影響

反應溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃條件下，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，亞硒酸鈉和多肽溶液體積比為1∶2，pH 8.0，反應時間120 min。

1.3.3.3 反應時間對螯合物中硒含量的影響

反應時間分別取10、20、30、60、90、120 min，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，亞硒酸鈉和多肽溶液體積比為1∶2，pH 8.0，反應溫度60 ℃。

1.3.3.4 pH值對螯合物中硒含量的影響

pH值分別取4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，亞硒酸鈉和多肽溶液體積比為1∶2，反應溫度60 ℃，反應時間60 min。

1.3.4 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以硒含量為指標，對pH值、反應時間、反應溫度和體積比這4 個因素進行響應面優(yōu)化，因素與水平設計見表1，試驗重復3 次。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels used in response surface design

1.3.5 硒含量的測定

采用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法[13]測定硒含量，計算如下式所示：

式中：p為從標準曲線中查得相當于硒的標準質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為甲苯萃取所得的樣品體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g；N為用于測定的樣品體積占總定容后樣品的體積分數(shù)/%。

1.3.6 紅外光譜測定

菌草靈芝多肽與菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖的測定采用KBr壓片法[14]。取固體樣品1 mg和干燥后的KBr 100 mg，放入瑪瑙研缽中混合研磨，研磨至粒度在2.5～2.0 μm以下；裝入壓片裝置中，加壓至20 MPa，維持1～2 min；取出壓片，呈半透明狀，利用傅里葉變換紅外光譜儀進行定性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 亞硒酸鈉與多肽溶液體積比對螯合物中硒含量的影響

圖1 體積比對硒含量的影響Fig. 1 Effect of the ratio of sodium selenite to peptides on selenium content

由圖1可知，當亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比為1∶2時，硒含量達到最高值，繼續(xù)添加亞硒酸鈉溶液，螯合物中的硒含量逐漸趨于平衡。由此可見，亞硒酸鈉溶液與菌草靈芝多肽溶液體積比對螯合物中硒含量影響較大，當亞硒酸鈉溶液的添加量較小時，螯合物的硒含量較低，可能是因為此時的硒離子含量較少，多肽過量，使得部分多肽無法與硒離子形成穩(wěn)定結構。最終選擇亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比1∶2。

2.1.2 反應溫度對螯合物中硒含量的影響

圖2 反應溫度對硒含量的影響Fig. 2 Effect of reaction temperature on selenium content

由圖2可知，溫度對螯合反應有一定的影響，螯合溫度到達60 ℃時硒含量最高，再繼續(xù)升高溫度硒含量略微降低。此結果與張曉霞[15]、毛學英[16]等的結論類似，溫度過高可能會使氨基酸或者小肽發(fā)生羰氨反應，與硒離子形成競爭，導致螯合能力降低，溫度過低會使螯合反應速率變慢[17]。

2.1.3 反應時間對螯合物中硒含量的影響

圖3 反應時間對硒含量的影響Fig. 3 Effect of reaction time on selenium content

由圖3可知，反應時間為10～60 min時，螯合物中的硒含量隨反應時間的延長而快速增高，當達至60 min時螯合物中硒含量達到最高。但是，當反應時間再延長時，硒含量卻有略微下降，之后趨于穩(wěn)定。此結果與馬利華[18]和金文剛[19]等研究結果一致，螯合時間過長反而不利于螯合反應的進行，易導致螯合物的結構變得不穩(wěn)定，阻礙了螯合反應的進行，從而使得硒螯合能力有所降低。

2.1.4 pH值對螯合物中硒含量的影響

圖4 pH值對硒含量的影響Fig. 4 Effect of pH on selenium content

由圖4可知，反應在酸性條件下進行時，螯合物中的硒含量較低。這可能是由于H+與硒離子競爭供電子基團[20]，阻礙了菌草靈芝多肽-硒螯合物的生成。當pH值在4.0～9.0之間時，隨著pH值的不斷升高，硒螯合能力快速提升，在pH 9.0時硒含量達到最高，但當pH值超過9.0后硒含量反而下降，可能是因為在強堿條件下發(fā)生了一系列的副反應，導致硒含量降低[21]。

2.2 螯合條件響應面試驗結果

2.2.1 數(shù)學模型的建立及顯著性檢驗

如表2所示，以菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量為響應值，采用Design-Expert回歸分析軟件分析表2中29 個試驗點的響應值，經(jīng)軟件綜合分析后，各試驗因素對菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量的影響可采用如下回歸方程表示：

硒含量/（μg/g）=2 487.84+419.73A+531.81B+ 205.44C+230.46D+193.87AB-205.60AC-62.59AD+ 385.68BC+43.83BD-104.99CD-262.45A2-481.08B2-222.15C2-438.21D2

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 響應面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic response surface model

回歸方程的方差分析結果見表3。對菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量而言，其因變量和全體自變量之間存在顯著的線性關系，R2=0.930 3，說明該方程是高度顯著的，其中響應值的改變有93.03%源自于所選變量，即體積比、pH值、反應溫度、反應時間，因此該回歸方程的擬合性較好，所建模型是可行的。由表3可知，A、B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2項都對響應值有顯著的影響，其影響強弱的排序為：pH值＞反應溫度＞體積比＞反應時間。通過對該回歸方程中的各項方差進行分析得出以下結論：從一次項角度可以看出pH值和反應溫度是影響菌草靈芝多肽-硒螯合物硒含量的主要因素；對于二次項除BC外都是由單因素中的顯著因素變成不顯著因素，進而表明了各試驗因素與該響應值之間的影響是由于其復雜的線性關系。因此，可以利用該回歸方程確定最佳螯合工藝條件是可行的。

2.2.2 響應面試驗分析及對菌草靈芝多肽硒-螯合物制備的優(yōu)化

通過Design-Expert軟件綜合分析得出所需的回歸方程，讓各因素保持不變，只對回歸模型進行降維處理，從而考察各因素間的交互作用對菌草靈芝多肽-硒螯合物硒含量產(chǎn)生的影響。通過對回歸分析結果數(shù)據(jù)處理，作出響應面和等高線圖，如圖5所示。響應值出現(xiàn)最大值，各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，具有顯著的相互作用關系，并且通過響應面圖能夠觀察出最高點[22-23]。說明pH值和反應時間之間存在著顯著的相互作用。

圖5 反應時間和pH值交互作用對硒含量影響的響應面圖Fig. 5 Response surface plot showing the effect of reaction time and pH of selenium content

利用Design-Expert軟件由所建的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量最高參數(shù)條件為：反應時間58.62 min、反應溫度76.78 ℃、pH 9、體積比3.15∶6。此優(yōu)化工藝下硒含量的預測值為3 075.29 μg/g，為適合實驗操作，調(diào)整條件為反應時間60 min、反應溫度75 ℃、pH 9、體積比1∶2。對實驗進行驗證得硒含量為（2 985.89±10.59）μg/g，該回歸方程可應用于實踐。

2.3 菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜分析

圖6 菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖Fig. 6 IR spectra of bioactive peptides from Ganodorma lucidum and their selenium chelate

由于菌草靈芝多肽鏈中含有氨基和羧基，所以紅外光譜圖中的吸收峰必然會隨著氨基的伸縮振動、變角振動和羧基的伸縮振動等的變化而發(fā)生改變，當硒離子與多肽發(fā)生一系列的反應時，吸收峰的峰位也必然會隨之發(fā)生變化。圖6是菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖，可以明顯看出，菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜曲線不同于菌草靈芝多肽。對菌草靈芝多肽的紅外光譜圖進行綜合分析發(fā)現(xiàn)，在2 924 cm-1和2 852 cm-1處的吸收為C—H伸縮振動引起的特征吸收峰[24]。而1 649 cm-1和1 564 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰屬于酰胺Ⅱ帶，是由N—H面內(nèi)彎曲振動和C—N伸縮振動所引起的[25]。1 410 cm-1屬于菌草靈芝多肽氨基酸殘基的羧基[26-27]，560 cm-1是由C＝O的面外彎曲引起。與菌草靈芝多肽的紅外光譜圖相比，當多肽與硒離子發(fā)生反應后，整個波形發(fā)生了變化：菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖在2 852 cm-1處的N—H伸縮振動峰消失了，推測應是誘導效應或者是偶極場效應導致其上面的電子云密度增大，力常數(shù)增大，頻率升高[28]，而在低波數(shù)1 075 cm-1處吸收加強也證實了這一點，有可能是由于Se—N發(fā)生配位而引起伸縮振動；與菌草靈芝多肽相比，多肽-硒螯合物在875 cm-1處C—H的特征吸收峰發(fā)生了紅移，是由C—H面外彎曲振動引起的，說明其參與了配位反應，并且在560 cm-1出現(xiàn)C＝O的反對稱振動吸收峰，推測應是硒離子與多肽上的羧基進行了螯合反應，這與Palika[29]、Zhao Lina[30]等的結論類似。通過對菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜對比可以看出，菌草靈芝多肽的氨基和羧基均參與了硒離子的配位，說明菌草靈芝多肽與硒螯合后生成了新的物質(zhì)。

3 結 論

利用響應面分析法優(yōu)化菌草靈芝多肽與硒螯合的最佳工藝條件為反應時間60 min、反應溫度75 ℃、pH 9、亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比1∶2，在此條件下制備的螯合物中硒含量為（2 985.89±10.59）μg/g，與響應面模型預測值3 075.29 μg/g無顯著性差異，該模型可很好地應用于螯合工藝條件的優(yōu)化。由紅外光譜分析可知，菌草靈芝多肽和硒離子發(fā)生螯合反應，生成了一種新型物質(zhì)，即菌草靈芝多肽-硒螯合物，為合成有機硒化合物提供了一種新的原料，同時也為菌草靈芝的開發(fā)利用提供了一個新的思路。

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Optimization of Chelation of Juncao Ganoderma lucidum Peptides with Selenium by Response Surface Methodology

ZHAO Lina1, CHEN Zihong2, CHEN Hao2, HUA Pengpeng2, LIU Bin1,2,*
(1. China National Engineering Research Center of Juncao Technology, Fuzhou 350002, China; 2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The purpose of the present study was to optimize the preparation of Juncao Ganoderma lucidum peptideselenium chelate using response surface methodology. The independent variables were pH, the ratio of sodium selenite solution to protein hydrolysate (V/V), reaction time, and temperature. The response was selenium content. A quadratic polynomial regression model was established and its reliability was validated. The chelate was characterized by infrared (IR) spectroscopy. The results showed that in decreasing order significance, pH, reaction temperature, the ratio of sodium selenite solution to protein hydrolysate and reaction time affected the selenium content of chelates, and the optimal values of these factors were 9, 75 ℃, 1:2 and 60 min, respectively. The selenium content of the obtained product was (2 985.89±10.59) μg/g. IR spectral analysis confirmed the chelation reaction between Juncao Ganoderma lucidum peptides and selenium ions and the generation of a new chelate. This study can provide a new approach for the development and utilization of Juncao Ganoderma lucidum.

Juncao Ganoderma lucidum peptide; chelation; response surface methodology; peptide-selenium chelate

10.7506/spkx1002-6630-201714029

TS201.2

A

1002-6630（2017）14-0187-06

趙立娜, 陳紫紅, 陳濠, 等. 響應面法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 187-192.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714029. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Lina, CHEN Zihong, CHEN Hao, et al. Optimization of celation of Juncao Ganoderma lucidum peptides with selenium by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(14): 187-192. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714029. http://www.spkx.net.cn

2016-10-08

國家自然科學基金青年科學基金項目（31501432）；福建省科技重大專項（2014NZ2002-1）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD15B01）；福建農(nóng)林大學校杰出青年項目（xjq201608）；福建省科學技術廳高校產(chǎn)學合作項目（2017N5003）

趙立娜（1984—），女，助理研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zln20002000@163.com

*通信作者：劉斌（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：liubin618@hotmail.com