薄層色譜畫像解析法快速判定魚肉的脂質(zhì)氧化度

于 慧，佐藤實(shí)，山口敏康，中野俊樹

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.日本東北大學(xué)農(nóng)學(xué)研究科，日本 仙臺(tái) 981-8555）

薄層色譜畫像解析法快速判定魚肉的脂質(zhì)氧化度

于 慧1，佐藤實(shí)2，山口敏康2，中野俊樹2

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.日本東北大學(xué)農(nóng)學(xué)研究科，日本 仙臺(tái) 981-8555）

為了快速判定魚肉的脂質(zhì)氧化度，建立薄層色譜畫像（thin layer chromatography image，TLC-i）解析法快速測(cè)定魚類氧化生成的極性化合物含量。取黃鰭金槍魚油0.5 μL點(diǎn)樣于硅膠板上，用正己烷-乙醚-醋酸（30∶70∶1，V/V）的混合液展開12 min后，3%醋酸銅磷酸溶液噴霧顯色，150 ℃加熱15 min后，將氧化生成的極性化合物通過面積分析軟件進(jìn)行半定量分析。結(jié)果表明，此方法測(cè)得的極性化合物含量與常用的過氧化值（peroxide value，POV）、羰基值（carbonyl value，CV）相比，具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.993 8和0.972 5。將此方法用于判定遠(yuǎn)東多線咸魚在4 ℃貯藏期間的脂質(zhì)氧化情況，發(fā)現(xiàn)極性化合物含量與POV具有較好的正相關(guān)性（R2=0.962 5）。將此方法用于判定鹽漬紅鮭在-5 ℃貯藏期間的脂質(zhì)氧化情況，發(fā)現(xiàn)極性化合物含量與a*值具有較好的負(fù)相關(guān)性（R2=-0.822 9）。結(jié)果表明，該方法具有簡(jiǎn)單化、快速化、微量化、可視化的優(yōu)點(diǎn)，且不需要昂貴的設(shè)備，適合魚肉脂質(zhì)氧化度的快速評(píng)價(jià)。

薄層色譜畫像解析；脂質(zhì)氧化；極性化合物；快速檢測(cè)

魚類由于含有豐富的多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（decosahexaenoic acid，DHA）等，在貯藏過程中極易氧化生成氫過氧化物，過氧化物逐漸進(jìn)一步分解生成醛、酮類物質(zhì)，這不僅使魚類的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值有所降低，還對(duì)人體健康產(chǎn)生很大危害，如促進(jìn)衰老，導(dǎo)致心腦血管疾病和腫瘤等[1-4]。目前常用的脂質(zhì)氧化測(cè)定法有過氧化值（peroxide value，POV）、羰基值（carbonyl value，CV）、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）、氣相色譜、液相色譜等[5-7]。POV是評(píng)價(jià)脂質(zhì)初級(jí)氧化產(chǎn)物氫過氧化物的主要指標(biāo)，也是油脂過氧化值國際通過分析方法。但此方法需要花費(fèi)大量的時(shí)間、玻璃儀器、溶劑和油脂，檢測(cè)成本高，檢測(cè)靈敏度較低，且過氧化物不穩(wěn)定，隨時(shí)會(huì)分解，只能粗略地反映脂質(zhì)氧化程度[8]。CV是評(píng)價(jià)脂質(zhì)次級(jí)氧化產(chǎn)物羰基化合物量的指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化度的另一重要指標(biāo)[9]。但此方法和POV一樣，操作繁瑣，需要花費(fèi)大量的時(shí)間。氣相色譜和液相色譜等多種色譜技術(shù)已用于測(cè)定脂質(zhì)的氧化程度，但是氣相色譜分析前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，此步操作可能會(huì)引起穩(wěn)定性較差的不飽和樣品物性變化，從而帶來檢測(cè)誤差[2]，且這些方法只適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，難以滿足生產(chǎn)中現(xiàn)場(chǎng)化測(cè)定的要求。為了開發(fā)簡(jiǎn)便、快速的魚肉脂質(zhì)氧化度的判定方法，本實(shí)驗(yàn)以黃鰭金槍魚油為例建立了薄層色譜畫像（thin layer chromatography image，TLC-i）解析法。魚類在氧化酸敗過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物及其分解產(chǎn)物、游離脂肪酸等[10-11]，會(huì)使其極性顯著增加，因此，脂質(zhì)氧化也可以通過極性化合物含量的檢測(cè)來表征。總脂質(zhì)經(jīng)薄層色譜分離后，將氧化生成的比甘油三酯極性強(qiáng)的化合物利用面積分析軟件進(jìn)行半定量，并利用該法評(píng)價(jià)遠(yuǎn)東多線咸魚和鹽漬紅鮭在低溫貯藏過程中的脂質(zhì)氧化度，以期為今后進(jìn)一步評(píng)價(jià)魚類的脂質(zhì)氧化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃鰭金槍魚油（Thunnus albacares） 日本Maruha Nichiro食品株式會(huì)社；遠(yuǎn)東多線咸魚（Pleurogrammus azonus）（PE保鮮膜包裝，4 ℃貯存）和冷凍鹽漬紅鮭（Oncorhynchus nerka）（真空包裝，-18 ℃貯存）日本宮城縣仙臺(tái)市超市。

2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，2,4-DNPH）、反-2-癸烯醛 美國Sigma公司；正丁醇、氯仿、冰醋酸、碘化鉀、乙醚、氫氧化鉀等均為分析純。1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；NF777型手持式色差計(jì) 日本電色工業(yè)株式會(huì)社；Silica gel 60 F254硅膠板 德國Meker公司。

1.3 方法

1.3.1 黃鰭金槍魚油的加速氧化

將魚油分裝在小玻璃皿（內(nèi)徑28 mm，深度13 mm）中，每個(gè)玻璃皿放3 mL，將其放入50 ℃的恒溫箱中保存，每天定時(shí)取樣測(cè)定。

1.3.2 遠(yuǎn)東多線咸魚總脂質(zhì)的提取

將遠(yuǎn)東多線咸魚置于4 ℃貯存，定時(shí)取其魚肉樣品5 g，按照Folch等[12]方法對(duì)其總脂質(zhì)進(jìn)行提取。

1.3.3 鹽漬紅鮭總脂質(zhì)的提取

將紅鮭切成7～8 cm長的魚段，隨機(jī)裝入保鮮袋中，分成2 組，一組充入氧氣，一組不做任何處理（以下分別稱為氧氣組和對(duì)照組），置于-5 ℃貯存。每周取其魚肉樣品5 g，按照Folch等[12]方法對(duì)其總脂質(zhì)進(jìn)行提取。

1.3.4 TLC-i解析法測(cè)定

用微量注射器取0.5 μL魚油，點(diǎn)樣于活化硅膠板上，用正己烷-乙醚-醋酸（30∶70∶1，V/V）的混合液展開12 min，后采用3%醋酸銅磷酸溶液噴霧顯色，150 ℃加熱15 min后，將氧化生成的極性化合物通過面積分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3.5 POV的測(cè)定

參照Bilinski等[13]的方法，稱取50 mg魚肉脂質(zhì)于20 mL玻璃瓶中，加入3 mL氯仿-醋酸（2∶3，V/V）混合液溶解，在通入氮?dú)鈼l件下，加入0.5 mL飽和KI溶液，攪拌1 min，后置于暗處5 min。取出后加3 mL蒸餾水，搖勻后加入淀粉指示劑1～2 滴，用0.01 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色褪去，記錄所需Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。同時(shí)作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。按公式（1）計(jì)算樣品POV：

式中：A為樣品滴定時(shí)所消耗的Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；B為空白實(shí)驗(yàn)滴定時(shí)所消耗的Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；F為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定度；S為樣品質(zhì)量/g。1.3.6 CV的測(cè)定

參照Endo等[14]的方法，定時(shí)稱取黃鰭金槍魚油10 mg用1 mL正丁醇溶解。取0.5 mL加入0.5 mL 0.05%的2,4-DNPH溶液，40 ℃水浴加熱20 min。冷卻至室溫后加入4 mL 8% KOH溶液混勻，2 000 r/min離心5 min。取上清液于波長420 nm處測(cè)定吸光度。另取0.5 mL反-2-癸烯醛標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述步驟操作，CV表示為μmol羰基化合物量/g魚油。

1.3.7 色差值的測(cè)定

定時(shí)取紅鮭魚肉6 g向其加入氯仿-甲醇（2∶1，V/V）的混合溶液27.5 mL，勻漿過濾。取其殘?jiān)偌尤肼确?甲醇（2∶1，V/V）的混合溶液16.5 mL，勻漿過濾后合并濾液。向其加入0.9% NaCl溶液，振蕩混勻，離心10 min得兩相液面。取下層氯仿溶液3 mL置于玻璃皿中，用手持式色差計(jì)測(cè)定紅度值（a*）的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Tukey-Kramer post-hoc test對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鰭金槍魚油極性化合物含量的測(cè)定

圖1 黃鰭金槍魚油貯藏過程中極性化合物含量的變化Fig. 1 Time course of the amount of polar compounds in yellowfin tuna oil during storage

從圖1A中第0天的展開圖譜可以看出，黃鰭金槍魚油中的甘油三酯含量較高，而磷脂含量較低。在50 ℃伴隨貯藏時(shí)間的延長，圖中Ⅰ部分的顏色逐漸加深，說明比甘油三酯極性強(qiáng)的化合物在逐漸形成，這些極性化合物是魚油氧化酸敗生成的比甘油三酯極性較強(qiáng)化合物的統(tǒng)稱，主要包括過氧化物、分解生成物、聚合物及游離脂肪酸等[10-11]。利用面積分析軟件將極性化合物Ⅰ占全脂質(zhì)（Ⅰ＋Ⅱ）的比例作為極性化合物含量的表示方法。如圖1B所示，極性化合物含量隨貯藏時(shí)間的延長逐漸增加，和圖1A中觀察到的Ⅰ部分顏色的變化趨勢(shì)基本一致。該方法平行處理5 份，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.15%～1.49%之間，可見該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。2.2 黃鰭金槍魚油的POV變化

POV是評(píng)判油脂氧化酸敗程度的重要指標(biāo)，一般POV越高其氧化酸敗程度也越嚴(yán)重[7]。如圖2A所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，曲線呈一定的上升趨勢(shì)，說明黃鰭金槍魚油發(fā)生了不同程度的氧化酸敗。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該曲線的上升趨勢(shì)與圖1B中極性化合物曲線的上升趨勢(shì)較為接近，比較極性化合物含量與POV的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們具有較好的正相關(guān)性（R=0.993 8）（圖2B）。

圖2 極性化合物含量與POV的相關(guān)性Fig. 2 Correlation between the amount of polar compounds and POV

2.3 黃鰭金槍魚油的CV變化

圖3 極性化合物含量與CV的相關(guān)性Fig. 3 Correlation between the amount of polar compoundsand CV

魚油在貯藏過程中受環(huán)境影響，首先氧化生成氫過氧化物，隨后分解成含羰基的化合物，這些二次產(chǎn)物中羰基化合物（醛、酮類化合物）的積聚量就是CV[9]。一般CV越高，其氧化生成的醛、酮等物質(zhì)的量越高。如圖3A所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，曲線呈一定的上升趨勢(shì)，說明黃鰭金槍魚油發(fā)生了不同程度的氧化酸敗。該曲線的上升趨勢(shì)也與圖1B中極性化合物曲線的上升趨勢(shì)較為接近，比較極性化合物含量與CV的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們也具有較好的正相關(guān)性（R=0.972 5）（圖3B）。結(jié)合極性化合物含量與POV也具有較好的正相關(guān)性，說明該方法有較好的精密度。以上結(jié)果說明利用TLC-i解析法測(cè)定該魚油的脂質(zhì)氧化度是可行的。

2.4 遠(yuǎn)東多線魚極性化合物含量的測(cè)定

圖4 遠(yuǎn)東多線咸魚貯藏過程中極性化合物含量的變化Fig. 4 Temporal changes in the amount of polar compounds in salted Pleurogrammus azonus during storage

咸魚由于風(fēng)味獨(dú)特、易于貯存，且魚肉中含有豐富的多不飽和脂肪酸，一直深受消費(fèi)者的喜愛[15]。遠(yuǎn)東多線魚主要分布于日本北海道周圍水域[16]，其含油量約為10%，多以腌制品形式銷售。但其鹽干品在加工及貯存過程中，脂肪容易氧化變質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)黃出油，造成不愉快的嗅感和味感[17-18]。遠(yuǎn)東多線咸魚在4 ℃貯藏過程中極性化合物含量的變化如圖4A所示。第0天的展開圖譜可以看出，遠(yuǎn)東多線咸魚的脂質(zhì)主要以甘油三酯和固醇的含量較高，也有少量的游離脂肪酸和磷脂。在貯藏第3～12天時(shí)，圖中Ⅰ部分的顏色較第0天有加深的趨勢(shì)，但不明顯，貯存第17天后，圖中Ⅰ部分的顏色較第0天明顯加深，說明此時(shí)遠(yuǎn)東多線咸魚已經(jīng)發(fā)生了氧化且產(chǎn)生了極性化合物。利用面積分析軟件計(jì)算得到的極性化合物含量的結(jié)果如圖4B所示，遠(yuǎn)東多線咸魚在貯藏3 d后的極性化合物含量較第0天顯著增加（P＜0.05），之后沒有太大波動(dòng)（P＞0.05），直到第17天后極性化合物含量顯著上升（P＜0.05），該結(jié)果與圖4A中觀察到的Ⅰ部分顏色的變化趨勢(shì)基本一致。

2.5 遠(yuǎn)東多線咸魚的POV變化

圖5 極性化合物含量與POV的相關(guān)性Fig. 5 Correlation between the amount of polar compounds and POV

如圖5A所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，曲線呈一定的上升趨勢(shì)，在第0天的POV較低，僅為6.46 meq/kg，在貯藏第3～12天期間，POV雖有所上升，但均小于15 meq/kg，直到第17天后，POV達(dá)到19.07 meq/kg，說明此時(shí)魚肉開始發(fā)生氧化。該曲線的變化趨勢(shì)與圖4B中極性化合物曲線的上升趨勢(shì)較為接近，比較2 種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們也具有較好的正相關(guān)性（R=0.962 5）（圖5B）。說明利用TLC-i解析法測(cè)定遠(yuǎn)東多線咸魚的脂質(zhì)氧化度是可行的。

2.6 鹽漬紅鮭極性化合物含量的測(cè)定

紅鮭，又名紅大馬哈魚，廣泛分布于從日本北部及俄羅斯至美國華盛頓州的北太平洋水域，是世界著名經(jīng)濟(jì)魚種之一[19]。因其亮麗的紅色肉質(zhì)和平均高達(dá)9%的含油量而深受消費(fèi)者的喜愛[20]。在日本，紅鮭去頭去臟后常被切成魚段，經(jīng)鹽漬后冷凍銷售。由于不飽和脂肪酸含量較高，在低溫貯藏過程中，魚肉逐步發(fā)生氧化酸敗，品質(zhì)逐漸降低[21]。鹽漬紅鮭在-5 ℃貯藏過程中極性化合物含量的變化如圖6A所示。氧氣組第0天的展開圖譜可以看出，鹽漬紅鮭脂質(zhì)中主要以甘油三酯和固醇的含量較高，也有少量的游離脂肪酸、甘油二酯和磷脂。伴隨貯藏時(shí)間的延長，圖中Ⅰ部分的顏色逐漸加深，說明鹽漬紅鮭發(fā)生了氧化酸敗且產(chǎn)生了極性化合物。而對(duì)照組在－5 ℃貯藏過程中Ⅰ部分的顏色也有加深的趨勢(shì)，但不如氧氣組圖譜變化顯著。利用面積分析軟件計(jì)算得到的極性化合物含量如圖6B所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，氧氣組和對(duì)照組的極性化合物含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，說明紅鮭都發(fā)生了不同程度的氧化酸敗。其中，氧氣組的曲線上升速率快于對(duì)照組，在第3周極性化合物的含量已達(dá)到8.83%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖6 鹽漬紅鮭貯藏過程中極性化合物含量的變化Fig. 6 Temporal changes in the amount of polar compounds in salted Oncorhynchus nerka during storage

2.7 鹽漬紅鮭a*值的變化

圖7 極性化合物含量與a*值的相關(guān)性Fig. 7 Correlation between the amount of polar compounds and a*

由于紅鮭體表顏色鮮艷，會(huì)對(duì)常規(guī)POV、TBARS等方法的測(cè)定造成干擾，本實(shí)驗(yàn)選用a*值來評(píng)價(jià)鹽漬紅鮭在-5 ℃貯藏期間體表顏色的變化。如圖7A所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，氧氣組和對(duì)照組的a*值呈一定的下降趨勢(shì)，在第3周氧氣組的a*值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說明鹽漬紅鮭在冷凍過程中橙色的顯色物質(zhì)蝦青素等類胡蘿卜素物質(zhì)因氧化而被破壞[21]。該曲線的下降趨勢(shì)與圖6B中極性化合物曲線的上升趨勢(shì)較為類似，比較2 種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們具有較好的負(fù)相關(guān)性（R=-0.822 9）（圖7B）。同時(shí)，有文獻(xiàn)[22]報(bào)道三文魚的a*值與TBARS值有很強(qiáng)的相關(guān)性，這些說明了在難以用常規(guī)的POV、TBARS等方法測(cè)定鹽漬紅鮭的脂質(zhì)氧化度中，利用TLC-i解析法測(cè)定具有潛在的價(jià)值。

3 討 論

魚類在貯藏過程中，由于受到酶、微生物、氧等內(nèi)外因素的影響，極易腐敗變質(zhì)。其中脂肪氧化是導(dǎo)致魚體腐敗變質(zhì)的主要原因。多不飽和脂肪酸的存在使魚體即使在低溫貯藏過程中易發(fā)生脂肪氧化，生成醛、酮、醇等化合物，不僅引起魚肉質(zhì)地、風(fēng)味變差，還縮短了保存期[23-24]。目前大部分的測(cè)定方法存在測(cè)定程序繁瑣、所需化學(xué)試劑多、時(shí)間長等問題，只適應(yīng)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，難以滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及現(xiàn)場(chǎng)化測(cè)定的要求[2]。

以甘油三酯為主成分的脂質(zhì)在氧化過程中，比甘油三酯極性較強(qiáng)的化合物在逐步形成[25]。食用油在高溫煎炸過程中，由于光、熱、水及微生物等作用，甘油三酯中不飽和脂肪酸的不飽和鍵發(fā)生氧化、裂解、聚合等一系列反應(yīng)，生成比甘油三酯極性大的一些化合物[26]。這些極性化合物的含量通常使用傳統(tǒng)方法層析柱分離法進(jìn)行測(cè)定，近年來也有運(yùn)用薄層色譜法通過特定指示劑在各種高溫氧化油中的比移值與極性化合物含量的線性關(guān)系來進(jìn)行測(cè)定[27]。該指標(biāo)的檢測(cè)目前在歐洲已成為煎炸油的管理指標(biāo)[28]。Kaitaranta等[25]曾利用棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（thin layer chromatography flame ionization detector，TLC-FID）定量測(cè)定在加速氧化過程中魚油所產(chǎn)生的極性脂質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)極性脂質(zhì)含量的增多與魚油質(zhì)量的增加具有直接的線性關(guān)系。木村友紀(jì)等[29]也曾利用TLC-FID來測(cè)定沙丁魚油在氧化過程中生成的氫過氧化物及極性更強(qiáng)的二次氧化產(chǎn)物。TLC-FID是將樣品液點(diǎn)在專用的色譜棒上，經(jīng)溶劑展開后，將此色譜棒通過適當(dāng)?shù)臋C(jī)械傳動(dòng)裝置，水平地穿過檢測(cè)氫火焰的中心，使化合物燃燒裂解，形成離子碎片和自由電子，再由電極收集它們并產(chǎn)生與化合物量呈正比的電流信號(hào)而測(cè)出各物質(zhì)的含量[30]。該方法雖然分離效果好，分析精度高，可快速簡(jiǎn)便地進(jìn)行脂質(zhì)成分分析，但需要昂貴的設(shè)備來實(shí)現(xiàn)操作。本實(shí)驗(yàn)以黃鰭金槍魚油為例建立了TLC-i解析法，魚油經(jīng)薄層色譜分離后，將氧化生成的比甘油三酯極性強(qiáng)的化合物利用面積分析軟件進(jìn)行半定量，其結(jié)果與POV、CV法相比具有較好的正相關(guān)性。同時(shí)，利用該法評(píng)價(jià)了遠(yuǎn)東多線咸魚在4 ℃貯藏過程中的脂質(zhì)氧化度，其結(jié)果與POV具有較好的正相關(guān)性。評(píng)價(jià)了鹽漬紅鮭在-5 ℃貯藏過程中的脂質(zhì)氧化度，其結(jié)果與a*值具有較好的負(fù)相關(guān)性。說明利用TLC-i解析法評(píng)價(jià)魚肉的脂質(zhì)氧化度是可行的。

該方法與目前常用的脂質(zhì)氧化評(píng)價(jià)方法POV相比，魚油所需量大幅降低，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中POV的滴定法[31]規(guī)定每測(cè)定一個(gè)樣品需要魚油2～3 g，Bilinski等[13]的解析法中魚油的需要量為50 mg，本實(shí)驗(yàn)所開發(fā)的TLC-i解析法魚油需要量?jī)H為0.5 μL，約是國家標(biāo)準(zhǔn)中魚油需要量的1/4～1/6。同時(shí)，該方法所需溶劑量較少，操作簡(jiǎn)單，多個(gè)樣品可同時(shí)分析，測(cè)定時(shí)間大大縮短，脂質(zhì)的氧化情況可從TLC圖譜中直觀看出。具有簡(jiǎn)單化、快速化、微量化、可視化的特點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用TLC分離、顯色、半定量分析處理方法，建立了TLC-i解析法快速測(cè)定魚類氧化生成的極性化合物含量的方法以評(píng)價(jià)魚肉的脂質(zhì)氧化度。取魚油0.5 μL點(diǎn)樣于硅膠板上，用正己烷-乙醚-醋酸（30∶70∶1，V/V）的混合液展開12 min后，3%醋酸銅磷酸溶液噴霧顯色，150 ℃加熱15 min后，將氧化生成的極性化合物通過面積分析軟件進(jìn)行半定量分析。其結(jié)果分別與POV、CV具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.993 8和0.972 5，且具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。將此方法用于判定遠(yuǎn)東多線咸魚在4 ℃貯藏期間的脂質(zhì)氧化情況，發(fā)現(xiàn)極性化合物含量與POV具有較好的正相關(guān)性（R=0.962 5）。將此方法用于判定鹽漬紅鮭在-5 ℃貯藏期間的脂質(zhì)氧化情況，發(fā)現(xiàn)極性化合物含量與a*值具有較好的負(fù)相關(guān)性（R= -0.822 9）。這些結(jié)果表明，該方法具有簡(jiǎn)單化、快速化、微量化、可視化的優(yōu)點(diǎn)，且不需要昂貴的設(shè)備，適合魚肉脂質(zhì)氧化度的快速評(píng)價(jià)。

[1] 米紅波, 劉爽, 李學(xué)鵬, 等. 天然抗氧化劑在抑制水產(chǎn)品貯藏過程中脂質(zhì)氧化的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(8): 364-368; 373. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.068.

[2] 孫月娥, 王衛(wèi)東. 國內(nèi)外脂質(zhì)氧化檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 中國糧油學(xué)報(bào), 2010, 25(9): 123-128.

[3] 藤本健四郎. 魚の脂質(zhì)の特徴と食品機(jī)能[J]. 日本調(diào)理科學(xué)會(huì)誌, 2006, 39(5): 271-276.

[4] LI H T, ZHOU X Q, GAO P, et al. Inhibition of lipid oxidation in foods and feeds and hydroxyl radical-treated fish erythrocytes: a comparative study of Ginkgo biloba leaves extracts and synthetic antioxidants[J]. Animal Nutrition, 2016, 2(3): 234-241. DOI:10.1016/ j.aninu.2016.04.007.

[5] 齋藤洋昭. 水産脂質(zhì)劣化の機(jī)構(gòu)と評(píng)価法の開発[J]. 中央水產(chǎn)研究所研究報(bào)告, 1996(8): 61-76.

[6] 李春煥, 王曉琴, 曾秋梅. 植物油脂氧化過程及機(jī)理、檢測(cè)技術(shù)以及影響因素研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(9): 277-284. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609046.

[7] 曹文明, 王鑫, 包杰, 等. 油脂氧化評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂, 2013, 26(4): 1-5.

[8] 張榮華, 陳瑤. 食用油脂過氧化值檢測(cè)方法的研究[J]. 糧食與食品工業(yè), 2012, 19(6): 97-100. DOI:10.3969/j.issn.1672-5026.2012.06.039.

[9] 王建輝, 劉永樂, 劉冬敏, 等. 凍藏期間草魚魚片脂肪氧化變化規(guī)律研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(6): 243-246.

[10] 陳蕾, 鮑俊杰, 王灼琛, 等. 偽劣油脂極性物質(zhì)的快速檢測(cè)研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2014(1): 59-61. DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2014.01.020.

[11] 李啟艷, 謝強(qiáng)勝, 刁飛燕, 等. 魚油的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(7): 1157-1161. DOI:10.16155/j.0254-1793.2016.07.03.

[12] FOLCH J, LEES M, STANLEY G H S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J]. Journal of Biological Chemistry, 1957, 226(1): 497-509.

[13] BILINSKI E, JONAS R E E, LAU Y C. Chill storage and development of rancidity in frozen Pacific herring, Clupea harengus pallasi[J]. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1978, 35: 473-477.

[14] ENDO Y, TOMINAGA M, MISAKO T E, et al. A modified method to estimate total carbonyl compounds in frying oils using 1-butanol as a solvent[J]. Journal of Oleo Science, 2003, 52(7): 353-358.

[15] 李君珂, 劉森軒, 劉世欣, 等. 花椒葉多酚提取物對(duì)白鰱咸魚脂肪氧化及脂肪酸組成的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(15): 109-113. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.015.

[16] 龐景貴. 日本北海道周圍水域遠(yuǎn)東多線魚(Pleurogrammus azonus)資源開發(fā)現(xiàn)狀[J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息, 1990(4): 13-14.

[17] LI J K, WANG F L, LI S, et al. Effects of pepper (Zanthoxylum bungeanum Maxim.) leaf extract on the antioxidant enzyme activities of salted silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) during processing[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 18: 1179-1190. DOI:10.1016/j.jff.2014.07.018.

[18] LI J K, HUI T, WANG F L, et al. Chinese red pepper (Zanthoxylum bungeanum Maxim.) leaf extract as natural antioxidants in salted silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) in dorsal and ventral muscles during processing[J]. Food Control, 2015, 56: 9-17. DOI:10.1016/ j.foodcont.2015.03.001.

[19] 王尊, 謝晶. 不同保鮮方法對(duì)三文魚品質(zhì)影響的研究進(jìn)展[J]. 包裝工程, 2016, 37(9): 80-85; 119.

[20] 張寧, 謝晶. 三文魚的保鮮方法及研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2015, 31(3): 256-259. DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2015.03.057.

[21] 張新林, 謝晶, 郝楷, 等. 不同低溫條件下三文魚的品質(zhì)變化[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(17): 316-321. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2016.17.053.

[22] 吳行印, 謝晶, 張新林, 等. 動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)三文魚在不同溫度的貨架期[J]. 包裝工程, 2017, 38(3): 1-6.

[23] 王亞青, 程裕東, 袁春紅. 凍藏過程中魚類脂肪氧化的研究現(xiàn)狀[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2003, 3(1): 97-101. DOI:10.3969/ j.issn.1009-7848.2003.01.018.

[24] 吳娜, 王錫昌, 陶寧萍, 等. 動(dòng)物源食品中脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物檢測(cè)的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014, 5(10): 3042-3046.

[25] KAITARANTA J K, KE P J. TLC-FID assessment of lipid oxidation as applied to fish lipids rich in triglycerides[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1981, 58(6): 710-713.

[26] 康雪梅. 煎炸油中極性成分測(cè)定方法的研究[D]. 鄭州: 河南工業(yè)大學(xué), 2015.

[27] 李昌模. 薄層色譜法測(cè)定油脂中極性化合物含量[J]. 中國油脂, 2007, 32(11): 77-79. DOI:10.3321/j.issn:1003-7969.2007.11.022.

[28] HARA S, OGAWA E, TOTANI Y. Evaluation of heat-deteriorated oils. Ⅰ. TLC-FID method for determining polar compounds content[J]. Journal of Oleo Science, 2006, 55(4): 167-172.

[29] 木村友紀(jì), 宮下和夫. イワシ油の酸化により生成する過酸化物とアルデヒド含量の関係[J]. 北海道大學(xué)水産科學(xué)研究彙報(bào), 2003, 54(3): 53-57.

[30] 彭元懷, 楊國龍, 畢艷蘭, 等. 棒狀薄層色譜/氫火焰離子化檢測(cè)器(TLC/FID)在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用[J]. 糧油加工, 2007(1): 49-51.

[31] 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品中過氧化值的測(cè)定: GB 5009.227—2016[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2016: 1-3.

Rapid Identification of Lipid Oxidation Levels in Fish by Thin Layer Chromatography Image Analysis Technique

YU Hui1, SATO Minoru2, YAMAGUCHI Toshiyasu2, NAKANO Toshiki2
(1. School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai 981-8555, Japan)

In this study, we developed a rapid method to determine the amount of polar compounds generated from lipid oxidation in fish based on thin layer chromatography (TLC) and image analysis in order to identify the extent of lipid oxidation in fish. The chromatographic separation of yellowfin tuna (Thunnus albacores) oil (0.5 μL) was performed on TLC plates using hexane-diethyl ether-acetic acid (30:70:1, V/V) as a mobile phase for 12 min. Color development was carried out by spaying the plates with 3% copper acetate in phosphoric acid and heating them at 150 ℃ for 15 min. The polar compounds derived from lipid oxidation during the heating process were semiquantitatively determined by area calculation with a special software. It was indicated that the amount of polar compounds measured by TLC was highly correlated with two common lipid oxidation parameters of peroxide value (POV) and carbonyl value (CV) with a correlation coefficient (R2) of 0.993 8 and 0.972 5, respectively. Furthermore, a good positive correlation between the measured amount of polar compounds and POV with a correlation coefficient of 0.962 5 was observed for salted Pleurogrammus azonus stored at 4 ℃, while salted sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) stored at ?5 ℃ showed a good negative correlation between this measured parameter and color parameter a* value with a correlation coefficient of ?0.822 9. These results strongly suggest that TLC image analysis has the advantages of simplicity, rapidity, microscale quantitation and easy visualization without the need for expensive equipment.

TLC-i analysis; lipid oxidation; polar compounds; rapid detection

10.7506/spkx1002-6630-201714047

TS207.7

A

1002-6630（2017）14-0304-06

于慧, 佐藤實(shí), 山口敏康, 等. 薄層色譜畫像解析法快速判定魚肉的脂質(zhì)氧化度[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 304-309.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714047. http://www.spkx.net.cn

YU Hui, SATO Minoru, YAMAGUCHI Toshiyasu, et al. Rapid identification of lipid oxidation levels in fish by thin layer chromatography image analysis technique[J]. Food Science, 2017, 38(14): 304-309. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714047. http://www.spkx.net.cn

2017-02-04

教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（第49批）；魯東大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目（LY2013022）

于慧（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：zoehuihui@hotmail.com