菲牛蛭的含量測(cè)定方法改進(jìn)及檢測(cè)中的注意事項(xiàng)

張利

摘要：改進(jìn)菲牛蛭的水蛭素含量測(cè)定方法及總結(jié)檢測(cè)中的注意事項(xiàng)，提高方法的重復(fù)性及準(zhǔn)確度，更有效地控制菲牛蛭的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：菲牛蛭；水蛭素；含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2017）03—0071-03

菲牛蛭為醫(yī)蛭科動(dòng)物（Poecilobdella manillensis），俗稱(chēng)金邊螞蟥，別名馬尼擬醫(yī)蛭，是吸血類(lèi)水蛭中個(gè)體較大的品種。其抗凝活性成分主要為水蛭素，其抗凝活性、抗血栓作用明顯高于非吸血類(lèi)水蛭，在治療人類(lèi)的心血管疾病，尤其是血栓性疾病具巨大的優(yōu)越性，中國(guó)藥典2015年版收載的藥用品種為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigra，Whitman、水蛭Hi-nude nipponica，Whitman或柳葉螞蟥Whitmania acran ulata，Whitman的干燥體，與菲牛蛭動(dòng)物品種來(lái)源不完全一致。云南省于2013年將菲牛蛭收錄到《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中?？紤]到簡(jiǎn)單易行，中國(guó)藥典2015版水蛭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及云南省的菲牛蛭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其水蛭素的含量測(cè)定均參照1970年Markwardt報(bào)道的凝血酶滴定法制定，其原理是根據(jù)水蛭素與凝血酶結(jié)合比例為1：1，而凝血酶已有國(guó)際單位NIH，水蛭素的活性以抗凝血酶活力單位ATU表示，一個(gè)ATU等于中和一個(gè)NIH凝血酶的水蛭素量，但此法受試劑及人為因素影響較大，重復(fù)性及準(zhǔn)確度不夠理想，有報(bào)道通過(guò)配制不同濃度梯度的凝血酶溶液，多次換試管重滴的濃度梯度法，重復(fù)性及準(zhǔn)確度較好，但操作繁瑣，耗時(shí)，不易掌握。筆者對(duì)菲牛蛭水蛭素含量方法進(jìn)行一定的改進(jìn)并提示檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)，以提高檢測(cè)的重復(fù)性及準(zhǔn)確度。

1儀器與試藥

超級(jí)恒溫水浴槽（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DELTA320酸度計(jì)（梅特勒一托利多公司）；菲牛蛭（批號(hào)150601、150607、150706），云南海瑞迪生物藥業(yè)有限公司；牛纖維蛋白原（批號(hào)140626-201310），牛凝血酶（批號(hào)140625-201009），中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為純化水；其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1原方法測(cè)定水蛭素含量

2.1.1供試液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入0.9%氯化鈉溶液15 mL，充分?jǐn)嚢?，浸?0 min，并時(shí)時(shí)振搖，過(guò)濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。2.1.2緩沖液的配制取0.2 mol·L^-1三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL與0.1 mol·L^-1鹽酸溶液約40 mL，加水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.4。

2.1.3凝血酶滴定液的配制 取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品適量，加生理鹽水制成每1 mL含凝血酶40個(gè)單位的溶液（臨用配制）。

2.1.4含量測(cè)定 精密量取續(xù)濾液100μL，置試管（8 mm×38 mm）中，加入含0.5%（牛）纖維蛋白原（以凝固物計(jì)）的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（臨用配制）200μL。搖勻，置水浴中（37±0.5）℃保溫5 min，滴加每1 mL中含40單位的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次2μL，邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗的體積，按下式計(jì)算。

U=C₁V₁/C₂V₂

式中u為每1 g含凝血酶活性單位（U·g^-1）；C₂為凝血酶溶液的濃度（U·mL^-1）；C₂為供試品溶液的濃度（g·mL^-1）；V₁為消耗凝血酶溶液的體積（μL）；V₂為供試品溶液的加入量（μL）

中和一個(gè)單位的凝血酶的量，為一個(gè)抗凝血酶活性單位，本品每1 g含抗凝血酶活性應(yīng)不低于60U。

2.2含量測(cè)定方法改進(jìn)

2.2.1滴定終點(diǎn)的確定 滴定過(guò)程中以觀察到試管內(nèi)出現(xiàn)凝固物為滴定終點(diǎn)，故受外界及人為因素影響較大。而原方法固定為每分鐘滴加2μL凝血酶溶液，活性規(guī)定為不低于60 U·g^-1，根據(jù)活性的計(jì)算公式1μL即可有約12 u·g^-1的差異。在測(cè)定中發(fā)現(xiàn)有時(shí)臨近終點(diǎn)有時(shí)只需再滴加1μL就發(fā)生凝固。另外觀察到滴定過(guò)程時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、搖動(dòng)過(guò)頻（超過(guò)15 min），不易觀察到凝固，10 min內(nèi)結(jié)束滴定方法的重復(fù)性較好。改進(jìn)滴定過(guò)程為：先滴加凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次5μL～2μL邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗的體積；新取試管1只，重新測(cè)定（根據(jù)初測(cè)時(shí)消耗的體積，調(diào)整每分鐘凝血酶的加入量，每次5μL-2μL），但在至近凝固時(shí)，改成每1 min滴加1次，每次1μL，滴定過(guò)程應(yīng)在10 min內(nèi)完成，記錄凝固時(shí)消耗凝血酶溶液的體積，以后一次消耗的凝血酶體積計(jì)算含量。

2.2.2提取方式考察 同一批樣品分別采用超聲15 min、30 min，振搖30 min、60 min 4種提取方式，結(jié)果提取結(jié)果一致，為方便易行采用振搖30 min提取。采用0.9%生理鹽水為提取溶劑，分別在室溫（約20℃）、37℃、50℃、70℃下30 min振搖提取，結(jié)果顯示，50℃、70℃下溫度下水蛭素的活性明顯下降。其他條件活性結(jié)果一致。故可保留原標(biāo)準(zhǔn)提取方式。

2.2.3滴定溫度 溫度對(duì)滴定過(guò)程影響大，同一批樣品分別在25℃、37℃、50℃、70℃滴定，在25℃、37℃溫度下滴定結(jié)果基本一致，后50℃、70℃溫度下活性下降了30%以上，故原標(biāo)準(zhǔn)滴定溫度可行。

2.2.4供試液pH對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響 配制同批供試液10份，并用1.0 mol·L^-1NaOH或1.0 mol·L^-1HCL分別調(diào)節(jié)pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5按

2.2.1項(xiàng)的滴定方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明供試液pH值4.5～7.0間，其抗凝活性基本穩(wěn)定（見(jiàn)表1），供試液pH值低于4.0時(shí)，溶液不澄清，無(wú)法觀察凝固現(xiàn)象，pH值太高則抗凝活性降低。用生理鹽水溶解后的供試品溶液pH值均在4.5-7.0之間。故供試液測(cè)定時(shí)無(wú)需調(diào)節(jié)pH值。

2.3結(jié)果 取3批樣品，按菲牛蛭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與改進(jìn)后方法分別進(jìn)行活性測(cè)定。3批結(jié)果見(jiàn)表2。

3討論

改進(jìn)每分鐘滴入固定量的凝血酶溶液的原活性測(cè)定方法，而根據(jù)初測(cè)預(yù)估消耗凝血酶溶液的體積，再換管重測(cè)，臨近終點(diǎn)時(shí)降低凝血酶溶液的滴入量，并限定滴定時(shí)間，可提高方法的重復(fù)性及準(zhǔn)確度。

纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液霉變會(huì)影響凝固物觀察，故都應(yīng)臨用新配。樣品溶液、纖維蛋白原及凝血酶溶液均應(yīng)澄清，否則會(huì)造成滴定終點(diǎn)提前。

每次的應(yīng)輕微搖動(dòng)，否則易造成原來(lái)凝固物分散。觀察是否出現(xiàn)凝固時(shí)不應(yīng)將試管拿出水面，整個(gè)滴定過(guò)程都應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行。

水蛭素的活性單位是根據(jù)中和凝血酶單位的量來(lái)確定，凝血酶保存不當(dāng)效價(jià)會(huì)降低，故凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按要求妥善保存，必要時(shí)候應(yīng)重測(cè)其效價(jià)，以保證結(jié)果樣品含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

（收稿日期：2016-11-01）