飼糧中添加海南霉素對奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

辛杭書 段春宇 張永根 王明君 李仲玉 王志博 李富國

(東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030)

甲烷是反芻動物瘤胃正常消化的產(chǎn)物，瘤胃內排放的甲烷量占甲烷排放總量的15%～25%，而且反芻動物甲烷排放損失的能量占到飼料攝入能量的2% ～12%［1］。因此，抑制瘤胃甲烷的產(chǎn)生對提高飼料能量利用率和減輕溫室效應具有重要的意義。海南霉素是近年中科院藥物研究所研制的國內第1個羧基型聚醚類離子載體，它與瘤胃素、鹽霉素結構相似，與莫能菌素有許多共同之處，是一種新型的反芻動物飼料添加劑［2］。它可以有效地降低反芻動物甲烷的排放量［3－4］，并具有保護瘤胃肽和可溶性蛋白質的作用［5－6］，能改變山羊瘤胃發(fā)酵類型，明顯提高丙酸比例，抑制飼料蛋白質在瘤胃內的降解;在體外發(fā)酵試驗中，能有效地減緩瘤胃液pH下降、減少產(chǎn)氣量、減少氨態(tài)氮的含量、降低乙酸和丙酸比［7］，并且改變了瘤胃微生物區(qū)系。但體外試驗有很多局限性，如果在動物飼糧中添加海南霉素是否同樣會通過改變微生物區(qū)系來調控甲烷產(chǎn)量?調控機理是否相同呢?基于此，設計了本試驗，旨在研究奶牛飼糧中添加海南霉素對其瘤胃微生物區(qū)系的影響，為海南霉素調控甲烷產(chǎn)生的機理性研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧組成

選用3頭體況良好，體重相近(460.0±20.6)kg，安裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，精粗比為50∶50。海南霉素和莫能菌素分別由山東勝利股份有限公司和美國禮來公司贈送，純度均≥90%，飼喂前混合于精料中飼喂。

1.2 試驗設計

試驗采用3×3拉丁方試驗設計。試驗設2個對照組:負對照組飼喂基礎飼糧;正對照組在基礎飼糧添加中350 mg/d莫能菌素。海南霉素組在基礎飼糧中添加20 mg/d海南霉素。預試期10d，正試期5d，共15d。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(DM basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在東北農(nóng)業(yè)大學香坊試驗基地進行。試驗牛拴系飼養(yǎng)，每日飼喂2次(08:00和20:00)，先粗后精，自由飲水。

1.4 樣品采集

每階段正試期的第4、5天晨飼前(0 h)、晨飼后2、4、6、8和10 h于瘤胃腹囊處采集瘤胃液，用無菌的2層紗布過濾，用滅菌離心管取瘤胃液迅速放入液氮罐，帶回實驗室后于－80℃保存。用于基因組DNA的提取。

1.5 樣品分析

1.5.1 瘤胃微生物總DNA的提取方法

采用珠磨－十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA，提取后，用紫外可見分光光度計測定提取的總DNA濃度和純度，取符合樣品的OD260nm與 OD280nm比值應在 1.6 ～1.8 之間(平均在1.75左右)，且用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA在加樣孔附近呈現(xiàn)一致密亮帶的樣品待測，－20℃保存。

1.5.2 反轉錄PCR檢測條件及引物的設計與合成

從瘤胃微生物總DNA中擴增細菌16S rDNA。

反轉錄 PCR反應體系:10×緩沖液2 μL，10 mmol/L的dNTP 0.4 μL，10 μmol/L 的引物各0.8 μL，25 mmol/L 的氯化鎂(MgCl2)1.6 μL，模板總 DNA 0.4 μL，TaqDNA 聚合酶 2 μL，雙蒸水為 13.6 μL，總體積為 20 μL。

反轉錄PCR反應參數(shù):95℃變性7 min;95℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

瘤胃微生物的16S rDNA全序列引物見表2［8］，本試驗用到的所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.5.3 實時定量PCR(qRT-PCR)的反應條件及引物的設計與合成

qRT-PCR的反應條件參照SYBR Premix Ex TaqTM 試劑建立25 μL反應體系及反應條件［3］。qRT-PCR的引物參照文獻［9－11］報道的瘤胃總細菌、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、真菌(fungi)、甲烷菌(Ruminococcus methanogen)和原蟲(protozoa)引物序列(表3)。

表2 瘤胃微生物的16S rDNA全序列引物Table 2 Primers of whole length 16S rDNA of rumen microorganisms

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Sequences of primers for qRT-PCR assay

1.6 統(tǒng)計分析

根據(jù)測得的閾值循環(huán)(Ct)和以下公式［3］將目標菌含量表示為相對于瘤胃總細菌16S rDNA的百分比:

目標菌含量(%)=100 ×［2－(目標菌Ct－總細菌Ct)］。

試驗數(shù)據(jù)用Excel初步記錄并做簡單處理，利用7500 System Software分析qRT-PCR結果。然后采用SAS 9.1軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用混合模型(mixed procedure)進行多重比較。

2 結果

2.1 瘤胃微生物DNA的反轉錄PCR產(chǎn)物的電泳檢測結果

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對反轉錄PCR產(chǎn)物進行檢測的結果見圖1。從產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、甲烷菌、原蟲和真菌的基因擴增片段的電泳結果可以看出，每個擴增產(chǎn)物均與預期擴增片段大小相符，并且擴增所得的目的片段均呈1條的亮帶，無雜帶和拖尾現(xiàn)象，說明設計的引物及提取的基因組DNA均可用于qRT-PCR。

2.2 瘤胃微生物的qRT-PCR結果

運用qRT-PCR技術，對瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、甲烷菌、原蟲和真菌含量的變化進行監(jiān)測。由表4可見，奶牛飼糧中添加海南霉素，極顯著降低了溶纖維丁酸弧菌、原蟲和真菌的含量(P＜0.01)，并且海南霉素對瘤胃微生物的抑制作用與莫能菌素正對照組相似。與負對照組相比，海南霉素將溶纖維丁酸弧菌、原蟲和真菌的含量分別減少了 38.24%、60.24% 和 12.73%，差異極顯著(P＜0.01)。而海南霉素和莫能菌素對瘤胃黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和甲烷菌的含量無顯著影響(P＞0.05)。

由圖2可見，海南霉素和莫能菌素對各個時間點的瘤胃溶纖維丁酸弧菌、原蟲和真菌均有明顯的抑制作用，并且各組每種菌的含量均隨著時間的變化而發(fā)生變化，雖然變化規(guī)律并不是很一致，但均呈現(xiàn)一定的持續(xù)性。其中，海南霉素組和負對照組的溶纖維丁酸弧菌隨著時間的增加而呈現(xiàn)先下降后升高再下降的趨勢，而正對照組則呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢;負對照組的原蟲變化沒有明顯的規(guī)律，其他2組則隨著時間的延長而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;真菌的變化規(guī)律比較一致，3組均為先升高后緩慢下降的趨勢;各個時間點的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的生長繁殖并沒有被海南霉素和莫能菌素明顯抑制，它們的含量也隨時間變化而變化，但變化仍無明顯的規(guī)律，其中，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌隨著時間的延長而先升高后下降，白色瘤胃球菌隨著時間的變化而呈現(xiàn)先下降后升高再緩慢下降的趨勢，對于黃色瘤胃球菌，3組的變化均無明顯的規(guī)律;海南霉素組和正對照組的甲烷菌含量與負對照組相似，均不受時間影響，且每組甲烷菌的含量始終穩(wěn)定在0.46% ～0.48%。

圖1 瘤胃細菌、真菌和原蟲DNA反轉錄PCR結果Fig.1 Reverse transcription PCR results of DNA of bacteria，fungi and protozoa in the rumen

表4 飼糧中添加海南霉素對奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響Table 4 Effects ofdietary hainanmycin on rumen microflora ofdairy cows %

圖2 飼糧中添加海南霉素對奶牛瘤胃細菌、原蟲、真菌含量的影響Fig.2 Effects ofdietary hainanmycin on contents of bacteria，fungi and protozoa in the rumen ofdairy cows

3 討論

瘤胃中的纖維降解細菌主要有黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌。據(jù)報道，莫能菌素和其他離子載體主要選擇性抑制革蘭氏陽性菌的生長，它們會在某些革蘭氏陽性菌的細胞膜積累，催促離子快速向細胞內運動，導致無益的離子流，同時菌體ATP酶活性升高，產(chǎn)生大量的ATP來抵制無益的離子流動，最終會導致細胞內能量耗盡，進而抑制菌體的生長繁殖［12－13］。但革蘭氏陰性菌不會被抑制，因為它的細胞膜外有一層脂多糖層，會抑制離子載體對細胞膜的入侵［14］。本試驗發(fā)現(xiàn)，奶牛飼糧中添加海南霉素后，瘤胃溶纖維丁酸弧菌的含量顯著降低，而黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的含量無顯著變化。溶纖維丁酸弧菌是革蘭氏陽性菌，飼糧中添加海南霉素后，它的生長被抑制，而產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是革蘭氏陰性菌，它的生長并沒有被明顯抑制。然而，黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌雖然都是革蘭氏陽性菌，但這2種細菌的細胞膜外也有類似于革蘭氏陰性細菌的脂多糖層，會抑制離子載體進入細胞膜，所以離子載體并不能有效抑制它們的生長［15－16］。

氫氣是瘤胃中甲烷形成的一種重要底物，有研究表明，離子載體能抑制產(chǎn)氫菌的生長，從而抑制了甲烷生成的重要底物——氫氣的積累，阻礙了合成甲烷的主要途徑，最終抑制了甲烷的生成。本試驗結果表明，飼糧中添加海南霉素和莫能菌素后瘤胃溶纖維丁酸弧菌含量顯著降低，劉薇等［3］模擬瘤胃內環(huán)境在體外培養(yǎng)條件下研究海南霉素對瘤胃微生物影響的結果也表明，海南霉素抑制了溶纖維丁酸弧菌的生長繁殖，溶纖維丁酸弧菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要由二氧化碳、氫氣、乙醇、乙酸、丁酸、甲酸和乳酸。因此，當它的數(shù)量顯著降低后，產(chǎn)生的氫氣也會降低，所以其數(shù)量的降低導致瘤胃內氫氣的生成減少，這也是瘤胃甲烷生成量降低的一個原因(甲烷產(chǎn)生量的數(shù)據(jù)見本課題組之前的研究報道［4］)。另外還有研究也表明，在飼糧中添加莫能菌素后，奶牛瘤胃溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量顯著降低［17］。

瘤胃中除大量的產(chǎn)氫氣細菌外，也存在大量產(chǎn)生氫氣的真菌，真菌在瘤胃發(fā)酵中產(chǎn)生乳酸、甲酸和乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物，其中，大部分的產(chǎn)物都能被甲烷菌利用生成甲烷。同時在電子傳遞過程中產(chǎn)生氫氣，這些真菌與甲烷菌之間存在著種間氫轉移，它們產(chǎn)生的氫氣會被甲烷菌利用合成甲烷，當真菌的生長受到抑制時，產(chǎn)物也會相應減少，而用于合成甲烷的底物的量就會減少，因此，甲烷的生成并將受到抑制。本試驗結果表明，莫能菌素都顯著抑制了瘤胃真菌的生長，這與Cann等［18］的研究結果一致，并且，Stewart等［19］研究也表明，莫能菌素能抑制無菌的半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真菌的生長，降低氫氣的生成。本試驗得出，海南霉素與莫能菌素的作用效果相似。

奶牛飼糧中添加莫能菌素顯著降低了瘤胃原蟲的數(shù)量，Nagaraja等［20］模擬瘤胃進行體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，莫能菌素導致原蟲數(shù)量大幅減少。由于甲烷菌和原蟲有內外共生的特性，故原蟲對于甲烷的生成亦有很大貢獻，離子載體抑制瘤胃甲烷的生成可能與原蟲數(shù)量下降有關，瘤胃原蟲表面附著瘤胃產(chǎn)甲烷菌，與原蟲形成共生體［21］。瘤胃原蟲的細胞膜內壁結合有多種脫氫酶催化各自的底物脫氫，產(chǎn)生的氫分子附著在原蟲上，而附著在原蟲上的產(chǎn)甲烷菌則能夠通過種間氫轉移利用這些氫分子合成甲烷［22］。當原蟲的數(shù)量降低時，產(chǎn)甲烷菌的可附著物減少，可利用的氫源減少，甲烷的生成量降低，并且減少了瘤胃發(fā)酵損失的能量。當飼糧中添加海南霉素時，瘤胃原蟲數(shù)量也顯著降低了，由此可見，海南霉素可能也存在與莫能菌素類似的影響機制。

Van Nevel等［23］研究表明，莫能菌素抑制瘤胃甲烷生成并不是對甲烷菌有特殊的毒害作用，而是抑制甲酸生成氫的反應。本試驗結果表明，莫能菌素對甲烷菌的生長繁殖幾乎沒有影響，這與Weimer等［24］的試驗結論相吻合，飼糧中添加莫能菌素后，產(chǎn)甲烷菌能適應飼糧添加莫能菌素的瘤胃環(huán)境，維持它們的數(shù)量。Hook等［25］通過6個月的試驗，采用qRT-PCR方法研究了莫能菌素對瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響，結果表明，莫能菌素沒有顯著影響瘤胃產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。飼糧中添加海南霉素后，瘤胃甲烷菌的數(shù)量也沒有顯著變化，說明海南霉素與莫能菌素相似，都沒有影響瘤胃甲烷菌的數(shù)量。由此可見，海南霉素和莫能菌素降低瘤胃甲烷的生成量并不是直接作用于瘤胃甲烷菌，而是作用于和甲烷生成相關菌或改變瘤胃發(fā)酵類型等方式來實現(xiàn)的。

4 結論

飼糧中添加海南霉素改變了瘤胃微生物區(qū)系，海南霉素對瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和甲烷菌含量無顯著影響，但顯著降低了溶纖維丁酸弧菌、原蟲和真菌含量。

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