都勻白及的組織培養(yǎng)與植株再生研究

胡單晶+聶蓮+楊紅艷

摘 要：近年來由于都勻本地野生白及被大量采挖，數(shù)量越來越少。因此，建立白及人工繁殖的方法，通過組織培養(yǎng)建立白及植株再生體系，實現(xiàn)都勻本地中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化大量種苗的需求。本次實驗通過植物組織培養(yǎng)技術，對白及進行培養(yǎng)獲得再生苗，然后進行增殖培養(yǎng)，在不同的培養(yǎng)基上人工快速繁殖，以尋找都勻白及無性快繁體系的培養(yǎng)條件。結果表明：最佳叢芽增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+6-BA 3ml/L+KT 1ml/L+2，4-D 1ml/L；最佳叢芽的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+6-BA 2ml/L+KT 1.5ml/L+ NAA 1ml/L。

關鍵詞：白及；中藥材；組織培養(yǎng)；無性快繁；都勻

白及（Bletilla striata Rchb.f.）屬蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla Rchb.f.）多年生草本植物?；ǖ念伾饕凶仙?、白色、黃色、紅色和藍色等，形奇特，可作盆景觀賞[1]。白及別名白及、干根、連及草[2]。藥用部分在中藥里又稱良姜、紫蘭。李時珍在《本草綱目》中解釋其名為：其根白色，連及而生，故曰白及。白及一般生長在灌木叢下、草坡或路旁濕潤處。主要分布于云南、陜西、四川、湖北、甘肅等省份，全國各地有少量栽培[3]。扁球形的假鱗莖，表面有環(huán)形紋帶，富有粘性。白及常以其塊莖根入藥，具有補肺，收斂止血，消腫生肌等功效[4-5]。近年來，隨著對白及的研究開發(fā)利用的不斷深入，白及不僅具有廣泛的藥用價值和園林價值外，也廣泛用于生產(chǎn)日用百貨，例如化妝品、高級陶瓷制造、紡織、橡膠等都需要白及的參與[6]。因為白及的利用價值，市場對白及的需求量也漸漸增大，野生資源急劇減少[7]。白及種子十分微小，在自然條件下繁殖效率低，成本高。所以采用組織培養(yǎng)繁殖十分有必要[8-10]。

白及的常規(guī)組織培養(yǎng)繁殖多為利用無菌播種，然后直接長大成苗的技術路線。從優(yōu)良單株為起點，保證基因一致性。通過此方法可實現(xiàn)全年均衡生產(chǎn)，更靈活地滿足市場需求，縮短生產(chǎn)周期，降低成本，從而加快推進白及中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化進程[11]。

本實驗采用植物組織培養(yǎng)技術，對分布于貴州省都勻市地區(qū)的野生白及進行培養(yǎng)，建立無性快繁體系，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)大量種苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白及（Bletilla striata Rchb.f.）于2015年9月采自都勻市綠茵湖社區(qū)高坡，憑證標本存黔南民族師范學院植物標本館。

1.2 方法

1.2.1消毒滅菌

假鱗莖先用75%酒精浸泡5-10s，立即用無菌水沖洗10次左右。后用0.1% HgCl2消毒5 min，立刻用無菌水漂洗3-8次，將消毒好的外殖體接種在已滅菌好的培養(yǎng)基上，移到培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

苗培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加相關激素：6-芐氨基嘌呤（6BA）、激動素（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）。應用正交表L16（4）4設計不同因素水平配比的培養(yǎng)基配方；pH值5.8-6.4為宜。

在超凈臺工作臺中將進行滅菌處理好的白及外植體接入相應的培養(yǎng)基中，置于溫度（20±3）℃，光照強度1500lx，光照時間為10h/d的條件下進行培養(yǎng)。

1.2.3誘導和繼代培養(yǎng)

將滅菌處理好的外殖體接種到設計好的培養(yǎng)基上，每7 d觀察1次，并做好相關各項記錄。

1.2.4白及的生根培養(yǎng)

將培養(yǎng)后的叢生芽分成單株，接種在生根培養(yǎng)基上，每7 d觀察1次，并作相應記錄。

2 結果與分析

本次實驗通過正交設計，可得16個處理梯度。每個梯度做1L的培養(yǎng)基，平均分裝在35個培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶接種10個叢芽數(shù)，1周后觀察并統(tǒng)計結果。

2.1 叢芽的增殖培養(yǎng)

由于此次實驗是在利用都勻白及的種子培養(yǎng)后的種苗為基礎進行增殖和生根培養(yǎng)，所以利用正交設計后，進行個梯度的培養(yǎng)，在實驗過程中，各個梯度都有增殖芽發(fā)生，但是統(tǒng)計下來，1/2MS+6-BA3ml/L+KT1ml/L+2，4-D1ml/L培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的增殖芽數(shù)最多，而且芽長勢優(yōu)良，粗壯茂盛，葉嫩綠發(fā)亮。其余的培養(yǎng)基的苗多少出現(xiàn)不同程度的問題。因此決定采用1/2MS+6-BA3ml/L+KT1ml/L+2，4-D1ml/L為增殖培養(yǎng)基進行后續(xù)的增殖培養(yǎng)，并且得到了大量的優(yōu)質組培苗。

2.2 叢芽的生根培養(yǎng)

在正交設計實驗過程中，同時也得到了苗的生根培養(yǎng)基。在本次試驗過程中，由于出現(xiàn)了有苗在5d后長根的現(xiàn)象，而且有根長勢正常，粗壯，長，不定根多的情況，因此在芽的生根培養(yǎng)時，直接采用這里面生根最多最好的培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，即1/2MS+6-BA2ml/L+KT1.5ml/L+NAA1ml/L。

3 討論

都勻白及在自然狀態(tài)中繁殖，或者在人們原生態(tài)的傳統(tǒng)種植方法下，白及的繁衍增殖幾率比較低，原本市場對白及的需求量就較大，于是會出現(xiàn)白及市場供不應求的情況。本實驗采用白及無性快繁的方式，縮短都勻白及的繁殖周期，在一定程度上滿足市場需求。在借鑒前人對白及快繁的研究成果時，發(fā)現(xiàn)前輩們都會在培養(yǎng)過程中除了加入相關的植物激素外，還在不同程度上加入香蕉泥、椰子汁和土豆泥等輔助成分。然而在本次試驗中，僅僅只是在基本培養(yǎng)基中加入一定量的相關激素，同樣可得到顯著的效果。這樣操作簡便，既節(jié)省精力又節(jié)約資本的方法，可在今后對都勻白及的工業(yè)化生產(chǎn)中大力推廣。

在植物組織培養(yǎng)與快速繁殖過程中，植物激素能在很大程度上影響著植物體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育。在培養(yǎng)過程中，一定量的植物激素是增殖分化、生根的必要條件，通常使用6-BA、KT、2，4-D以及NAA等較為常規(guī)的植物激素。6-BA和2，4-D利于愈傷組織分化成不定芽，且很快又分化為叢生芽。本次實驗過程中，當6-BA與2，4-D的濃度比為3：1時，可以快速得到大量的叢生芽。于是在后面的繼代增殖培養(yǎng)過程中，可加入適當?shù)?-BA和2，4-D，以便提高增殖系數(shù)，增加叢生芽的數(shù)量及產(chǎn)率。解決白及種苗快速繁殖過程中增殖緩慢，導致種苗培養(yǎng)周期長等關鍵性問題，加大了推進都勻本地白及組培種苗產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化的進程。

另外，在本次實驗過程中，還發(fā)現(xiàn)了在6-BA與NAA組合的培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，NAA濃度高的芽長得最粗壯。同時在這過程中，當沒有2，4-D時，6-BA與NAA比列為2：1時，苗生根情況良好。

盡管前人對白及的組培快繁研究取得了不小的成績，在白及人工快繁方面奠定了一定的基礎，但是都勻本地白及的工業(yè)化生產(chǎn)任然受到限制。于是，本次實驗利用白及種子通過植物組織培養(yǎng)技術，培養(yǎng)獲得的再生苗為外植體。在前人研究的基礎上，通過正交實驗設計方法，對再生苗進行增殖培養(yǎng)，誘導再生苗增殖分化產(chǎn)生大量叢生芽。同時，對叢生芽進行生根培養(yǎng)，使其形成完整植株。通過植物組織培養(yǎng)建立都勻白及植株再生快速繁殖體系，白及種苗增殖系數(shù)高，解決了都勻本地白及種苗來源問題?？稍谠型顿Y基礎上降低成本，大大的縮短了白及的培養(yǎng)周期。逐步實現(xiàn)都勻白及工業(yè)化生產(chǎn)，期望滿足市場對白及的大量需求。

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