蝴蝶蘭花梗腋芽組織培養(yǎng)探究

摘 要 以蝴蝶蘭花梗腋芽為外植體，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3～5 mg/L BA，增殖培養(yǎng)基為MS+3 mg/L BA+15%椰汁，生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA+150 g/L香蕉泥時(shí)獲得了最理想的培養(yǎng)效果。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；組織培養(yǎng)；激素

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.09.065

蝴蝶蘭也叫洋蘭，是蘭科蝴蝶蘭屬植物，多年生熱帶氣生蘭。蝴蝶蘭株形美觀、花姿婀娜、色彩艷麗、花期持久，在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美稱(chēng)。蝴蝶蘭因花形似蝴蝶而得名，在世界各國(guó)廣為栽培，是近年來(lái)在國(guó)際花卉市場(chǎng)上最受歡迎的洋蘭。蝴蝶蘭常規(guī)繁殖方法有分株法和播種法。在常規(guī)繁殖中，有3個(gè)難題：一是蝴蝶蘭屬單莖類(lèi)蘭花，植株極少發(fā)育側(cè)芽，用分株繁殖方法增殖緩慢；二是蝴蝶蘭的種子非常瘦弱，胚很弱小，種子中幾乎沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物貯藏，若在自然條件下繁殖，幾乎絕大多數(shù)種子會(huì)在發(fā)芽過(guò)程中死亡；三是嚴(yán)重感染病毒，導(dǎo)致種性降低。采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行蝴蝶蘭無(wú)性繁殖，可以在一定程度上解決上述問(wèn)題，因此目前大都是通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方式來(lái)大量繁殖蝴蝶蘭。

雖然根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物體的任何器官、任何組織和細(xì)胞都可以作為組培快繁的外植體，但實(shí)際上，蝴蝶蘭的不同器官和組織擁有不同的分化再生能力，因此選擇最適宜的外植體十分重要。蝴蝶蘭的組培外植體主要有葉片、花梗腋芽、花梗節(jié)間、莖尖、根尖等，其中花梗腋芽因具有取材和滅菌容易、不傷及母株、組培效果好等優(yōu)點(diǎn)而成為蝴蝶蘭組培的最佳外植體。

1 材料與方法

1.1 外植體

選擇已過(guò)盛花期帶休眠芽的花梗作為外植體。

1.2 初代培養(yǎng)

取蝴蝶蘭花梗，除去已開(kāi)放的花朵和未開(kāi)放的花蕾，在自來(lái)水下用細(xì)軟毛刷輕刷表面，并吸干表面水分，將花梗剪成長(zhǎng)4 cm左右的花梗段（腋芽上下各2 cm），剝?nèi)ヒ秆客獾陌?，放入?jīng)高溫滅菌過(guò)的燒杯中，在工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌：加入75%的酒精浸泡10 s；0.1%的HgCl2滅菌

6 min，滅菌后用無(wú)菌水沖洗5次，每次2 min；將帶芽莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。切取外植體的工具要銳利，同時(shí)切割動(dòng)作要快，防止擠壓，以免使材料受傷；切取外植體時(shí)切口或切點(diǎn)要適宜、準(zhǔn)確，例如：切花梗時(shí)，下端切口45°，上端切口平面。

蝴蝶蘭花梗接種到不同激素濃度的培養(yǎng)基上，每天光照12 h，光強(qiáng)1 600 Lx，溫度（25±2）℃，生長(zhǎng)7 d后在花梗的基部有褐色物質(zhì)產(chǎn)生，腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，1 月后腋芽可以長(zhǎng)到1.5 cm高，出芽率可達(dá)50%。

1.3 增殖培養(yǎng)

50 d之后，花梗基部和培養(yǎng)基逐漸變黑，將長(zhǎng)出的芽選取約1.5 cm高的苗，取出后切去葉片和基部褐化部分，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，大約40 d后，增殖倍數(shù)可達(dá)到3倍以上。

1.4 生根培養(yǎng)

將高約2.0 cm的蝴蝶蘭試管苗接種到生根培養(yǎng)基中，50 d后全部生根，平均生根3.5條，長(zhǎng)2.5 cm。

1.5 馴化移栽

移栽前7 d內(nèi)，在培養(yǎng)室內(nèi)將蝴蝶蘭培養(yǎng)瓶封口膜松開(kāi)，使空氣進(jìn)入培養(yǎng)瓶與幼苗接觸。2 d之后，移栽到基質(zhì)中轉(zhuǎn)移到煉苗室內(nèi)，使幼苗完全暴露在自然空氣中，煉苗期間要用遮陽(yáng)網(wǎng)適當(dāng)遮陽(yáng)，避免高溫灼燒和強(qiáng)光直接照射。移栽方法：將已生根的蝴蝶蘭組培苗從培養(yǎng)瓶取出，小心洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到滅菌后的苔鮮基質(zhì)中。用鑷子劃出痕跡后，夾住蝴蝶蘭組培苗的根部，插入基質(zhì)中，深度以至第1輪葉為好，用手仔細(xì)壓實(shí)，覆蓋薄膜，室溫保持在21～25 ℃，相對(duì)濕度65%～80%，控制好溫度和水分，移栽成活率可達(dá)85%以上。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出新葉、新根伸長(zhǎng)時(shí)，用0.3%～0.5%磷酸二氫鉀進(jìn)行葉面施肥，每周1次即可，成苗率可以達(dá)到85%以上。

2 結(jié)果討論

第一，以蝴蝶蘭花梗腋芽為外植體，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3～5 mg/L BA，增殖培養(yǎng)基為MS +BA3 mg/L +椰汁15%，生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L IBA+0. 05 mg/L NAA+150 g/L香蕉泥時(shí)獲得了最理想的培養(yǎng)效果。

第二，和其他蘭科植物一樣，蝴蝶蘭在組培快繁生產(chǎn)中極易出現(xiàn)褐變死亡的現(xiàn)象。因此防止褐變成了蝴蝶蘭組培快繁成功的關(guān)鍵。研究表明，添加2 g/L的活性炭時(shí)效果較為顯著；及時(shí)去除蝴蝶蘭培養(yǎng)物的褐變部分并經(jīng)常更換新鮮的繼代培養(yǎng)基，能有效抑制蝴蝶蘭外植體褐變死亡現(xiàn)象的發(fā)生。

第三，外植體的來(lái)源是決定蝴蝶蘭組培成敗的重要因素。首先，在選擇外植體時(shí)，應(yīng)先選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)變異的母株。其次，在采取外植體之前5～7 d，用殺菌劑噴灑蝴蝶蘭母株，這種采前預(yù)處理的方式，可在很大程度上預(yù)防和降低污染，提高初代培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)出芽的成功率。最后，采取外植體的最佳時(shí)間為第一朵花現(xiàn)蕾時(shí)的花梗腋芽。

第四，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖與芽的分化有著決定性的作用。蝴蝶蘭組培快繁過(guò)程中最常用的細(xì)胞分裂素為6-BA，大量研究資料表明，當(dāng)采用低濃度的6-BA時(shí)有利于原球莖的增殖，而用高濃度的6-BA時(shí)會(huì)促進(jìn)多酚氧化酶作用，產(chǎn)生大量醌類(lèi)物質(zhì)，使原球莖發(fā)生褐變。低濃度的NAA對(duì)原球莖增殖和出苗均有促進(jìn)作用，高濃度的則不利。

第五，天然復(fù)合物對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖和分化的影響。往培養(yǎng)基中加入一些天然復(fù)合物，如椰汁、黃熟的小香蕉泥等，能為培養(yǎng)物提供一些必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如微量元素、生理活性物質(zhì)和植物生長(zhǎng)激素等，在培養(yǎng)基中加入100～200 g/L的香蕉泥，對(duì)培養(yǎng)基的pH值具有較大的緩沖作用，可促進(jìn)蝴蝶蘭幼苗的發(fā)育。水解酪蛋白也是天然復(fù)合物，它對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖也有明顯的促進(jìn)作用，但若將水解酪蛋白和香蕉勻漿組合使用卻對(duì)適得其反，它會(huì)抑制蝴蝶蘭原球莖的增殖，可能天然復(fù)合物之間會(huì)發(fā)生相互作用，或者天然復(fù)合物與培養(yǎng)基之間的相互作用也可能對(duì)原球莖增殖有影響。許多研究資料表明，添加適量的椰乳、黃熟的香蕉泥或含膠質(zhì)的果蔬汁等均對(duì)原球莖增殖有明顯促進(jìn)效果。如果在培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭也會(huì)對(duì)原球莖增殖產(chǎn)生影響，低濃度（0.5～1.0 g/L）的活性炭對(duì)原球莖增殖影響不明顯，高濃度（2.0～3.0 g/L）的活性炭對(duì)原球莖增殖有促進(jìn)作用，但原球莖易出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。蔗糖是培養(yǎng)基的能源物質(zhì)，也是培養(yǎng)基的滲透調(diào)節(jié)劑，對(duì)原球莖的增殖影響較大，2%濃度的蔗糖有利于原球莖生長(zhǎng)，2%～3%濃度的蔗糖可以促進(jìn)蝴蝶蘭芽的形成，5%的蔗糖則有利于根的分化和生長(zhǎng)。

第六，繼代培養(yǎng)次數(shù)的控制。大多數(shù)蝴蝶蘭品種培養(yǎng)材料在組培過(guò)程中會(huì)隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而逐漸衰退，主要表現(xiàn)在種性退化、生長(zhǎng)不良、再生能力和增殖率下降、變異率提高等。

第七，壯苗生根。為了提高移栽成活率，通常在生根移栽之前會(huì)進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。壯苗的關(guān)鍵在于選擇合適的激素種類(lèi)和濃度，一般需要適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的激素含量，以便形成健壯苗。常用的植物生長(zhǎng)激素有IBA、NAA。研究表明，在壯苗生根階段，無(wú)機(jī)鹽成分是影響蝴蝶蘭叢生芽生根率的主要原因，其次是培養(yǎng)基中蔗糖的量，最后是NAA和多效唑。

（責(zé)任編輯：趙中正）

收稿日期：2017-02-18

作者簡(jiǎn)介：盧娟（1978—），女，湖北宜昌人，碩士，講師，主要研究方向?yàn)閳@林園藝、水保、水文等。