鵝細(xì)小病毒VP3蛋白抗血清的制備及在鴨胚和鴨胚成纖維細(xì)胞中的增殖研究

牛銀杰, 劉柏含, 趙麗麗, 孫 暢, 陳洪巖

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 哈爾濱 150069)

鵝細(xì)小病毒VP3蛋白抗血清的制備及在鴨胚和鴨胚成纖維細(xì)胞中的增殖研究

牛銀杰, 劉柏含, 趙麗麗, 孫 暢, 陳洪巖

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 哈爾濱 150069)

目的 制備鵝細(xì)小病毒(GPV) VP3衣殼蛋白的兔抗血清, 在紹興麻鴨鴨胚及其成纖維細(xì)胞中成功增殖GPV。方法 根據(jù)GPV H 分離株的VP3基因序列構(gòu)建原核表達(dá)載體pET3a -VP3，誘導(dǎo)純化VP3蛋白, 皮下注射免疫新西蘭白兔, 收集和純化VP3抗血清, 經(jīng)Western blotting檢測(cè)VP3抗血清與VP3蛋白的反應(yīng)性。GPV H株鵝胚尿囊液接種SPF紹興麻鴨胚和其成纖維細(xì)胞, 通過(guò)PCR反應(yīng)和間接免疫熒光方法, 檢測(cè)GPV在鴨胚及其成纖維細(xì)胞中的增殖。結(jié)果 成功制備了VP3的兔抗血清，同時(shí)GPV在鴨胚及其成纖維細(xì)胞中進(jìn)行良好增殖。 結(jié)論 VP3抗血清的制備及GPV在紹興麻鴨鴨胚及成纖維細(xì)胞中的增殖實(shí)驗(yàn)為GPV分子生物學(xué)特性及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

鵝細(xì)小病毒(GPV); VP3基因; VP3抗血清; 增殖

小鵝瘟(Gosling plaque)，是由鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus, GPV)引起的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病, 該病具有病程短、傳染性強(qiáng)、傳播快、死亡率高等特點(diǎn)[1]。GPV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，病毒粒子為六角形或球形,無(wú)囊膜，其基因組為單鏈、線性DNA，大小約5.2 kb，由兩個(gè)開(kāi)放讀碼框組成，右側(cè)讀碼框編碼衣殼蛋白VP1，VP2和VP3，左側(cè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2[2]。其中VP3衣殼蛋白是GPV的主要衣殼蛋白, 約占衣殼蛋白總量的80%, 是主要免疫保護(hù)型抗原蛋白[3-5]。目前，GPV的夾心ELISA 方法還未建立，因此VP3抗血清的制備是十分必要。

GPV對(duì)體外培養(yǎng)物的專(zhuān)一性很強(qiáng)，初代分離培養(yǎng)GPV時(shí)，只能用鵝胚、番鴨胚及鴨胚成纖維細(xì)胞(DEFs)，其他細(xì)胞和禽胚均不能使其增殖。GPV 經(jīng)鵝胚連續(xù)培養(yǎng)十幾個(gè)代次后，在DEFs中培養(yǎng)，不能形成病變, 培養(yǎng)物中病毒的滴度也很低。病毒分離及繁殖的局限阻礙了GPV致病機(jī)制及其生物學(xué)特性的研究。

本實(shí)驗(yàn)在麻鴨胚及其DEFs培養(yǎng)增殖GPV, 利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP3蛋白, 制備VP3兔抗血清, 為GPV診斷方法的建立及其致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

質(zhì)粒pET30a由本實(shí)驗(yàn)室保存，DEFs由本實(shí)驗(yàn)室制備; 紹興麻鴨鴨胚取自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(黑)2011-008], [SYXK(黑)2011-022];感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)和DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司。SPF 新西蘭白兔購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品有限公司[SCXK(吉)-2013-0002]。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

T4 DNA 連接酶和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司。質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自全式金公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司。弗氏完全佐劑和不完全佐劑購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自索萊寶。兔源紅外標(biāo)記抗體購(gòu)自LI-COR公司。

1.3 病毒的增殖

200 mL GPV 尿囊液接種8個(gè)11日齡紹興麻鴨,記錄鴨胚的死亡情況, 并觀察胚體的變化。同時(shí)在DEFs上接種GPV, 觀察細(xì)胞的病變情況。收取尿囊液和細(xì)胞上清, 提取病毒DNA, 進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 載體的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)H 株VP3基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，上游: CGGGATCCA TGGCAGAGGGAGG AGGCGGAGCTT(下劃線為酶切位點(diǎn)); 下游: CCAAGCTTTTACAGATTTTGAGTTAGATATCTG(下劃線為酶切位點(diǎn))擴(kuò)增VP3基因。將擴(kuò)建成功的VP3與載體pET30a進(jìn)行雙酶切, 凝膠回收后, 使用T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL(DE3)，挑取菌落PCR鑒定陽(yáng)性菌，經(jīng)測(cè)序鑒定成功的重組質(zhì)粒命名為pET 30a-VP3。

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)純化

將活化后的重組菌液1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL含100 mg/L Kana的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至A600=0.4～ 0.6, 1∶100加入誘導(dǎo)劑IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)的菌液進(jìn)行蛋白純化。

1.6 抗血清的制備

將純化好的蛋白與等體積的弗氏佐劑充分乳化后, 每只兔1 mg的用量進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。初次免疫使用完全佐劑，二次和三次免疫使用不完全佐劑, 其時(shí)間間隔為2周。經(jīng)兔耳緣靜脈采血, 采用間接ELISA測(cè)定兔血清效價(jià)。三次免疫后間隔1周加強(qiáng)免疫, 心臟采血, 分離血清, 分裝后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blotting鑒定抗血清的反應(yīng)原性

分別收集小量誘導(dǎo)表達(dá)純化的蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用半干法將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC膜)上，進(jìn)行封閉2 h，洗膜3次每次5 min后，加入1∶200稀釋的兔抗血清室溫孵育2 h, PBST 漂洗一抗后加入1∶8 000稀釋兔源紅外標(biāo)記抗體，室溫溫育1 h，洗膜3次后，紅外掃描保存結(jié)果。

1.8 間接免疫熒光檢測(cè)

制作原代DEFs細(xì)胞，消化細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，接種100個(gè)50%組織細(xì)胞感染量(TCID50) GPV, 37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2溫箱中培養(yǎng)48 h后，VP3抗血清為一抗，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，利用倒置熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 病毒的增殖情況

GPV接種鴨胚4 d后, 無(wú)鴨胚死亡, 觀察胚體無(wú)明顯病變, 與對(duì)照一致。而DEFs在120 h出現(xiàn)病變。提取尿囊液核酸, PCR鑒定在1 605 bp位置出現(xiàn)條帶(圖1), 證明GPV在鴨胚中進(jìn)行了良好的增殖。

圖1 GPV增殖的PCR鑒定Figure 1 Identification of GPV replication by PCR

2.2 原核載體pET30a-VP3的鑒定及VP3蛋白表達(dá)

pET30a-VP3測(cè)序結(jié)果正確。誘導(dǎo)表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)純化大小與預(yù)期VP3蛋白大小一致，約為70 000,證明成功表達(dá)VP3蛋白(圖2)。

圖2 重組VP3蛋白的SDS-PAGED的鑒定Figure 2 Identification of recombinant VP3 protein by SDS-PAGE

2.3 Western blotting鑒定多克隆抗體的特異性檢測(cè)

Western blotting結(jié)果表明兔多抗具有特異性和良好的反應(yīng)原性(圖3)。

2.4 間接免疫熒光

VP3抗血清與接種GPV的DEFs反應(yīng)良好，與沒(méi)有接毒的細(xì)胞無(wú)反應(yīng)(圖4)。進(jìn)一步說(shuō)明GPV在DEFs中具有良好的增殖。

圖3 VP3的Western blotting鑒定Figure 3 VP3 identification of Western blotting

3 討論

GPV的自然宿主是鵝和番鴨，所有品系的家鵝均易感，除番鴨和莫斯科鴨外，其他動(dòng)物均無(wú)易感性[6]。GPV在進(jìn)行初次分離時(shí)，只能用鵝胚和番鴨胚或是它們的原代成纖維細(xì)胞才能使它們?cè)鲋尺M(jìn)行分離。在本研究中，利用紹興麻鴨及其

圖4 VP3的間接免疫熒光鑒定Figure 4 VP3 identification of Indirect immunofluorescence

DEFs增殖GPV，結(jié)果表明，GPV能在麻鴨胚及其DEFs進(jìn)行良好的增殖。GPV在麻鴨胚及其DEFs的增殖為GPV致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

GPV的基因編碼衣殼蛋白VP1, VP2和VP3，他們有共同的羧基端。其中VP3是主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白的80%[7]。VP3蛋白氨基酸序列大多位于病毒粒子的表面, 含有GPV的主要抗原決定簇, 可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[8]。為了構(gòu)建夾心ELISA方法,作者構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-VP3, 誘導(dǎo)表達(dá)了VP3蛋白, 免疫新西蘭白兔, 制備了VP3兔抗血清。VP3蛋白和VP3抗血清的成功制備, 為VP3蛋白單抗的制備及其診斷方法的建立提供了便利條件。

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[2] 殷震, 劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 第2版. 北京: 科學(xué)出版社, 1997:1165-1167.

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Preparation of Goose Parvovirus VP3 Antiserum and Identification of Propagation in Duck Embryo and Duck Embryo Fibroblasts

NIU Yin-jie, LIU Bai-han, ZHAO Li-li, SUN Chang, CHEN Hong-yan
(Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China)

ObjectiveTo prepare antiserum against VP3 protein and propagate goose parvovirus (GPV) H in duck embryo and duck embryo fibroblasts (DEFs) .MethodsThe prokaryotic expression vector pET30a-VP3 were constructed based on VP3 seqeucne of GPV H. VP3 protein was induced, expressd and purified, then immunized the New Zealand white rabbit. The VP3 antiserum was collected, purified and verified by Western blotting. GPV H fluid was inoculated into shaoxing duck embryo and DEFs, and the propagation of GPV was identified by PCR and indirect immunofuorescence. Result The VP3 antiserum was successfully prepared, and GPV H was well propagated in shaoxing duck embryo and DEFs .ConclusionVP3 antiserum preparation and GPV replication in duck embryo and DEFs may be provided basis for GPV molecular biological characteristic and pathogenic mechanism research.

Goose parvovirus (GPV); VP3 gene; VP3 antiserum; Propagation

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0240-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.014

2017-04-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAI07B02-02); 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(Y2016PT41); 黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD2016006)

牛銀杰(1987-), 女, 博士研究生, 研究方向: 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail: niuyinjie0530@163.com;

共同第一作者: 劉柏含(1992-), 女, 碩士研究生,研究方向: 微生物學(xué)。E-mail: liubaihan456@163.com

陳洪巖(1963-), 男, 博士, 研究員, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: chenhongyan@caas.cn