ICR小鼠感染呼腸孤病毒III型的實驗研究

羅銀珠, 張 鈺, 何麗芳, 黃碧洪, 吳瑞可, 閔凡貴, 潘金春, 袁 文, 王 靜, 郭鵬舉, 黃 韌

(廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣州 510663)

ICR小鼠感染呼腸孤病毒III型的實驗研究

羅銀珠, 張 鈺, 何麗芳, 黃碧洪, 吳瑞可, 閔凡貴, 潘金春, 袁 文, 王 靜, 郭鵬舉, 黃 韌

(廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣州 510663)

目的 利用呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo-3)感染ICR小鼠，分析小鼠的臨床體征、靶器官病毒載量及血清抗體水平的動態(tài)變化。方法 通過動物體內(nèi)適應(yīng)試驗增強病毒毒力，利用尾靜脈注射與腹腔注射途徑建立系統(tǒng)性感染ICR小鼠模型，觀察動物臨床體征，于感染0 d、4 d、7 d、18 d、25 d、35 d、72 d、129 d分別采集小鼠(2～3只小鼠)血液并剖檢。47 d、81 d、103 d隨機對3只小鼠進行血液采集跟蹤。采用實時 qPCR方法檢測靶器官病毒核酸量，ELISA方法檢測血清抗體水平。結(jié)果 病毒經(jīng)過4次小鼠體內(nèi)適應(yīng)其毒力明顯增強。小鼠攻毒后6 d、7 d、9 d、10 d、11 d、16 d出現(xiàn)死亡，實時qPCR結(jié)果顯示，肝臟病毒載量最高，其次是心、脾、肺。多數(shù)器官病毒載量峰值出現(xiàn)在6～11 d, 129 d后，多數(shù)靶器官檢測陰性。血清抗體最早在18 d達(dá)到陽性，25 d達(dá)到峰值，并維持高抗體水平至試驗結(jié)束。結(jié)論 小鼠體內(nèi)適應(yīng)方法可以明顯增強Reo-3毒力，該病毒感染可引起小鼠多器官炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致小鼠死亡。本研究為該病毒模型建立及致病機理研究提供了參考數(shù)據(jù)。

呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo-3); 感染; 臨床研究; 呼吸道腸道病

呼腸孤病毒(Reovirus, Reo)是人獸共患病毒[1],能從人及多種動物如貂、河蝦、蟹、禽、鴨、豬、羊、牛等分離到。該病毒由編碼10個片段的雙股RNA組成, 屬于呼腸病毒科, 正呼腸病毒屬[2]。呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo-3)是該病毒屬的代表株。該病毒可感染所有哺乳動物，包括小鼠、倉鼠、豚鼠、貓和犬等[3]。Reo-3 感染人，能引起幼年兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾病[4,5]。感染動物能引起動物急性的呼吸窘迫綜合征和肺組織纖維化，腦炎，也可隱性感染動物并在體內(nèi)產(chǎn)生抗體,給血液制品、單克隆抗體、細(xì)胞培養(yǎng)等外來致病因子的檢定及動物試驗帶來一定的困難[1]。Reo-3在實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測(GB14922.2-2011)中被列為 SPF 等級實驗動物必須排除的病原微生物。目前對哺乳動物呼腸孤病毒的結(jié)構(gòu)、功能及分子生物學(xué)方面研究較多，而針對小鼠系統(tǒng)性感染模型的臨床及相關(guān)報道不多，本實驗經(jīng)尾靜脈和腹腔注射Reo-3感染ICR小鼠，并進行長達(dá)18周的血清學(xué)及組織核酸監(jiān)測，為防控與研究Reo-3及呼吸道腸道病毒疾病提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞株

Reo-3購自美國典型菌種保藏中心(ATCC VR-824)，BHK-ATCC細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2 實驗動物

3周齡SPF級雄性ICR小鼠24只，體質(zhì)量15～18 g，購自北京維通利華[SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所負(fù)壓感染動物實驗室內(nèi)[SYXK(粵)2012-0122]，自由飲食，動物實驗開展經(jīng)廣東省實驗動物監(jiān)測所動物使用和管理委員會批準(zhǔn)(IACUC2015003)。實驗前，隨機剖殺2只動物經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和QPCR檢測確定為Reo-3抗原抗體陰性。

1.3 主要試劑和儀器

ELISA抗體檢測試劑盒購自美國Express Bio公司, 酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司。熒光定量PCR儀ABI 7500購自美國ABI公司, DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司, RNA提取試劑TRizol購自美國Invitrogen公司, DNA聚合酶購自中國大連寶生物公司, 其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.4 QPCR引物合成

所用Reo-3引物參照參考文獻[6]。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 病毒滴度測定

將Reo-3接種BHK細(xì)胞，吸附作用1 h后加入含體積分?jǐn)?shù)2%血清的維持液，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，70%細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)后收獲病毒液，反復(fù)凍融3次，離心取上清液作為感染病毒，并用qPCR對病毒拷貝數(shù)進行定量。

表1 Reo-3引物序列Table 1 Primer sequences of Reo-3

1.6 動物回歸試驗

取濃度約為3.1×106拷貝/mL的Reo-3細(xì)胞培養(yǎng)病毒液尾靜脈和腹腔注射病毒液各0.2 mL/只，感染后3 d剖殺，取感染鼠的肝和肺進行研磨，離心后獲得病毒液上清，重復(fù)感染小鼠，反復(fù)4次。最后一次獲得的組織研磨上清液, 放-80 ℃, 備用。

1.7 感染動物試驗

取經(jīng)過體內(nèi)適應(yīng)增毒后的Reo-3病毒液，濃度為1.5×107拷貝/mL，尾靜脈和腹腔注射病毒液各0.2 mL/只。動物接種病毒后，觀察129 d。每日記錄動物的被毛、行為活動、飲食和精神狀態(tài)。并在小鼠感染后4 d、7 d、18 d、25 d、35 d、72 d和129 d對2～3只小鼠進行眼眶采血后脫頸椎處死并采集心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、盲腸內(nèi)容物置-20℃保存?zhèn)溆?。在感染實驗進行過程中的47 d、81 d、103 d, 隨機抽取3只小鼠進行眼眶采血分離血清置-20 ℃保存待測血清抗體。

1.8 QPCR檢測各組織病毒核酸含量

稱量適量組織, 加入600 mL的PBS緩沖液于組織研磨機上研磨3～5 min，將組織勻漿。研磨后，10 000 r/min離心10 min, 取200 mL上清抽提核酸，具體步驟參照核酸提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)說明書。最后應(yīng)用ABI 7500 Real-Time PCR System，Taqman RT-PCR兩步法試劑盒(Takara)即95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s, 進行40個循壞，熒光信號采集設(shè)于60 ℃，溶解曲線設(shè)置為: 95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min， 50 ℃ 30 s，進行熒光定量PCR檢測鑒定。

1.9 小鼠血清抗體檢測

根據(jù)試劑盒說明進行操作與讀數(shù)判定: 樣本稀釋及加樣, 將血清樣本從1∶50稀釋, 再向ELISA 微孔板各加100 mL稀釋好的樣本; 37 ℃孵育后洗板, 每孔加100 mL酶標(biāo)二抗, 37 ℃孵育后洗板, 加顯色液;反應(yīng)完畢, 立即用酶標(biāo)儀讀數(shù), 測試波長為405 nm。

1.10 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)束, 所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒動物回歸試驗

為提高病毒在小鼠體內(nèi)適應(yīng)能力，本實驗進行了4次小鼠體內(nèi)適應(yīng)試驗，結(jié)果顯示，病毒初次接毒后體征不明顯、不死亡、而適應(yīng)毒接毒后小鼠體征加重。初次感染小鼠，病毒在體內(nèi)增殖慢并且含量減低 (圖1A)，多次體內(nèi)適應(yīng)后，體內(nèi)主要臟器肝、脾、肺病毒載量升高(圖1B)，表明病毒適應(yīng)后感染能力及毒力增強。

2.2 臨床觀察

采用經(jīng)過小鼠回歸試驗后含有Reo-3的組織研磨上清感染ICR小鼠，潛伏期(0～5 d)小鼠出現(xiàn)立毛、扎堆，個別小鼠精神差，運動減少; 發(fā)病期(6～18 d)，感染鼠立毛明顯，并出現(xiàn)腹式呼吸，感染后6 d，7 d，9 d，10 d，11 d，16 d，小鼠出現(xiàn)死亡，剖檢見肺有出血，肝有白色壞死點，胃脹氣，脾縮小; 恢復(fù)期(19～129～d)，小鼠狀態(tài)逐漸良好，精神好轉(zhuǎn)。

圖1 Reo-3病毒小鼠體內(nèi)適應(yīng)結(jié)果Figure 1 Reo-3 virus adaption to mice

2.3 血清抗體滴度變化

感染小鼠體內(nèi)抗體滴度隨著感染時間遷移而升高，接種后18 d抗體陽性，之后抗體效價逐漸升高，在25 d抗體稀釋度達(dá)到128倍并維持至129 d (抗體稀釋度達(dá)512倍)(表2)。

2.4 組織病毒含量變化

2.4.1 靶器官核酸含量變化 感染早期小鼠以肝病毒載量最高(圖2A), 其次是心、脾、肺(圖2B,C,D)。肝以6 d (3.3×106拷貝/mL)含量最高(圖2A),心在11 d(4.5×105拷貝/mL)(圖2B)，肺在18 d(2.9×104拷貝/mL)(圖2C)，腦在4 d(4.3×105拷貝/mL) (圖2D), 脾在6 d(8.7×103拷貝/mL)(圖2E)，腎在18 d(1.9×104拷貝/mL)(圖2F), 并隨著時間推移小鼠各組織內(nèi)病毒核酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢，到129 d除心和脾外檢測到少量核酸外，其他組織均檢測不到病毒核酸。

表2 感染小鼠抗Reo-3血清抗體的測定Table 2 Determination of serum antibody against Reo-3 of infected mice

2.4.2 胃腸消化道核酸含量變化 感染后的小鼠取胃及盲腸內(nèi)容物進行核酸檢測，結(jié)果顯示病毒可以在胃中緩慢增殖，但到感染4個月后檢測不到(圖3A)。盲腸內(nèi)容核酸檢測除1只能檢測到外，其余的均不能檢測出來(圖3B)，該結(jié)果暗示該病毒在本實驗中基本不經(jīng)糞便排毒和傳播。

2.4.3 死亡鼠主要臟器及組織核酸 感染實驗后6 d, 7 d, 9 d, 10 d, 11 d, 16 d分別死亡1只(圖5)。臟器核酸結(jié)果顯示早期死亡小鼠(6 d, 7 d)肝和腦病毒載量高于其他組織，暗示兩個器官為病毒早期增殖和損傷的主要器官。肝的核酸含量在不同時間死亡小鼠中均呈現(xiàn)高載毒量，顯示病毒在小鼠肝臟大量復(fù)制，是致死的重要因素。肝、脾、肺、腎、胃病毒載量以7 d死亡鼠核酸含量最高，并呈現(xiàn)隨著時間推移逐步減低。

3 討論

圖2 感染小鼠各內(nèi)臟組織核酸測定(n=1～3)Figure 2 Content of Reo-3 nucleic acids in organs of infected mice (n=1～3)

圖3 感染小鼠胃腸道核酸含量變化 (n=1～3)Figure 3 Content of Reo-3 nucleic acids in gastrointestinal tract of infected mice (n=1～3)

呼腸孤病毒具有宿主譜廣泛的特點, 除人外, 從自然感染的小鼠、禽、犬、貓、牛、豬、獼猴、黑猩猩、昆蟲、魚，蝙蝠等體內(nèi)都分離到呼腸孤病毒[7-11]。根據(jù)國際病毒分類委員會第七次報告, 正呼腸孤病毒屬分3個亞群。非融合基因哺乳動物正呼腸孤病毒(MRV)屬于第一個亞群。該亞群目前有4個血清型(Reo-1, Reo-2, Reo-3, R4)[2,12]。Reo-3 病毒在鼠群中常呈隱性感染，威脅實驗動物的健康, 進而影響動物實驗的可靠性和準(zhǔn)確性[13-14]。據(jù)報道[14]，1980年代上海地區(qū)普通級鼠群感染率達(dá)35%，血清陽性率5.8%，屏障小鼠血清陽性率1.9%, 感染呈間發(fā)性流行, 時隱時現(xiàn)。近年報告[15]顯示該病毒在SPF級實驗鼠中流行率低。本實驗室2015年對野鼠Reo-3抗體陽性率抽檢陽性率30% (24/80)。2007年英國研究者[16]曾對野外捕獲小鼠進行病原血清調(diào)查表明 Reo-3陽性率10%。目前，該病毒在實驗動物病原微生物質(zhì)量檢測中被列為必須檢測項目，要求陰性。

圖4 死亡小鼠核酸含量變化 (n=1)Figure 4 Content of Reo-3 nucleic acids in dead mice (n=1)

本實驗通過人工攻毒方式模擬感染小鼠后，出現(xiàn)了急性死亡及慢性帶毒感染。死亡病例集中于感染后2周內(nèi)，之后至18周小鼠均呈現(xiàn)隱性感染。肺是呼腸孤死亡小鼠的主要靶器官，小鼠死前均表現(xiàn)出腹式呼吸，呼吸困難，精神差等的呼吸綜合癥候，此與人感染Reo體征[17]有相近之處且實驗操作簡單, 是研究人感染Reo或藥效評價的良好模型。

本實驗從體內(nèi)組織肝, 肺，心，腦，脾，腎等多臟器分離到病毒，且病毒攜帶時間大于4周，心與腦攜帶病毒時間長達(dá)18周仍然能檢測到病毒核酸。這結(jié)果與研究報道[13]病毒污染鼠群的可引起多種系統(tǒng)性疾病，包括壞死性肝炎、心肌炎、胰腺炎以及腦膜炎結(jié)果一致。本實驗證實了該病毒可穿透血腦屏障，在腦內(nèi)定殖從而損傷腦組織，需引起重視。心在本實驗中直到實驗結(jié)束129 d仍能檢測到，暗示著該病毒有可長時間存在于血液循環(huán)而引起病毒血癥，該結(jié)果也顯示在一些血制品衛(wèi)生安全方面需引起重視。

小鼠經(jīng)人工病毒感染后呈現(xiàn)全身性多組織多器官感染，感染早期病毒在各臟器定殖擴增并能引起動物死亡，隨著時間推移小鼠各組織內(nèi)病毒核酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢，部分臟器內(nèi)病毒逐漸被機體清除，此結(jié)果顯示動物自身免疫系統(tǒng)在抗病毒中發(fā)揮重要作用, 在某些臟器內(nèi)限制了病毒的復(fù)制及損傷, 表現(xiàn)在臨床上動物死亡率減少, 動物狀態(tài)恢復(fù)。

研究報道[18]Reo-3在動物群體中通過空氣和糞-口途徑傳播，并且有人認(rèn)為 Reo-3在環(huán)境中能穩(wěn)定生存是造成病毒污染的主要原因，主要通過水平傳播和垂直傳播兩種方式進行傳播，其中以呼吸道和消化道傳播為主要傳播方式。本實驗針對呼吸道(肺)及胃腸進行臨床跟蹤及核酸檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染早期肺病變明顯，出血，充血，動物出現(xiàn)呼吸困難綜合征，食欲下降，胃的核酸檢測結(jié)果顯示病毒呈低滴度復(fù)制。而盲腸內(nèi)容檢測結(jié)果除一只死亡鼠檢測陽性外其余均為陰性。作者推測該毒株在經(jīng)過多次動物全身性適應(yīng)試驗后可能改變了排毒途徑，消化道傳播方式減弱或消失，以呼吸道水平傳播為主。

綜上所述，小鼠感染Reo-3可作為研究Reo-3的良好模型。呼吸道傳播方式對該病的防控提供有效指導(dǎo)方向。通過抗體來監(jiān)測該病毒有效期可為18周或更長。以上對研究呼腸孤病毒及相關(guān)呼吸道腸道病提供了良好實驗數(shù)據(jù)。

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Research on Reovirus III (Reo-3) Infection in ICR Mice

LUO Yin-zhu, ZHANG Yu, HE Li-fang, HUANG Bi-hong, WU Rui-ke, Min Fan-gui, PAN Jin-chun, YUAN Wen, WANG Jing, Guo Peng-ju, HUANG Ren
(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China)

ObjectiveTo establish reovirus type 3 ( Reo-3) infection model of ICR mice and observe clinical syndrome, investigate virus load in target organs and serology dynamic change in infected mice. Method Animal adaption method was used to increase the virus’s virulence. Systemic infection model was established with tail vein and intraperitoneally inoculation to ICR. The clinical sign was observed. The tissues and serums were harvested on 0 d before and 4 d、7 d、18 d、25 d、35 d、72 d、129 d after inoculation. Blood samples of three mice were randomly collected on 47 d、81 d、103 d. qPCR and ELISA were respectively used to detect the virus nucleic acid at target tissue and the antibody level .ResultsVirus virulence was increased after four times adaption trial. Mice death was observed at d7, d9, d10, d11, d16 post inoculation. The highest load of the virus was found in liver through qPCR, followed by heart, spleen, and lung. The peaks of viral load emerged from 6 to 11 d in all organs, negative results appeared at 129 d in the most organs. The earliest antibody detect time was on 18 d. The titer of antibody hit the peak on 25 d, then maintained a high level till to 129 d .Conclusionvirus virulence can be enhanced significantly through mouse in-vivo inoculation, multiple organs inflammation and early death in mice can be identified by the systemic infection way of Reo-3. This experiment provides an approach to establish Reo-3 infected mice animal model and provides good experimental data for further research on Reo-3 infection mechanism .

Reovirus type 3(Reo-3); Infection; Clinical research; Respiratory intestinal disease

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0198-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.005

2016-12-30

廣東省科技計劃項目(2014B070706006)、(2013B060400028)

羅銀珠(1983-), 女, 碩士, 獸醫(yī)師, 研究方向: 病原學(xué)及實驗動物模型研究。E-mail: agluo122@sina.com

黃 韌(1959-), 男, 博士, 研究員。E-mail: labking@sohu.com